Drug Resistenz gegen gezielte Therapeutika ist weit verbreitet und die Notwendigkeit, die Mechanismen der Resistenz zu identifizieren – vor oder nach dem klinischen Einsetzen – ist entscheidend für die Führung alternative klinische Management-Strategien. Hier präsentieren wir ein Protokoll zu koppeln, Ableitung von Medikamenten-resistenten Linien in vitro mit Sequenzierung zur Entdeckung dieser Mechanismen zu beschleunigen.
Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.
Detaillierte molekulare Charakterisierung von Tumor Genome durch robuste Sequenzierungstechnologien und verbesserte Datenanalysewerkzeuge hat zur Entdeckung der wichtigsten genetischen Veränderungen in bestimmten Krebsarten 1,2 geführt. Entwicklung von gezielten Therapien bei diesen genetischen Läsionen, wie HER2, BCR-ABL, EGFR und ALK abzielen, haben sich deutlich verbessert die Lebensqualität für die Patienten 1,2. Doch trotz der Spezifität dieses Ansatzes, das klinische Ansprechen auf die meisten Einzeltherapien hat suboptimal war als Widerstand letztendlich entsteht. Vor kurzem hat bedeutende Fortschritte im Verständnis der molekularen Grundlagen der Resistenz gegen gezielte Therapeutika erzielt. Interessanterweise ist es immer klar, dass ein prominenter Mechanismus der Resistenz beinhaltet anhaltende Ziel / Signalweg-Aktivität. Als ein Beispiel dafür, Androgen-Rezeptor (AR) -dirigierten Enzalutamid Behandlung von Prostatakrebs führt zu Anreicherung von aktivierenden Mutationen im AR selbst, die Aufrechterhaltung AR-Signalisierung output in Gegenwart des Inhibitors 3-5. Diese Erkenntnis hat zu einer aggressiven Kampagne, um 1 LED) zu entwickeln Antagonisten der dritten Generation, die auch weiterhin sowohl WT und Mutanten-AR-Funktion in drücken kann Enzalutamid feste PCa 3 und 2) identifizieren potenzielle nachgeschaltete Knoten des AR-Signalisierung, die für eine therapeutische Intervention ausgerichtet werden kann . In ähnlicher Weise eine Resistenz gegen andere Klassen von Inhibitoren, wie jene für EGFR, BRAF und ABL häufig Mutationen, die die ursprüngliche süchtig-Kinase-Weg 1 Reaktivierung führen.
Mit dem Wissen, dass der Widerstand zwangsläufig bei den meisten Patienten tritt, die Entwicklung von Konzepten, um zügig zu bringen, diese Mechanismen, um Licht Entwicklung wirksamer Follow-up-Therapien ermöglichen. Ein Ansatz, der vielfältig eingesetzt wird ist es, die Genomik von klinischen refraktären Tumoren in Bezug auf nicht vorbehandelten oder sensitiven Tumoren, um Anreicherungen / Abreicherungen in genetische Läsionen, die zugänglich d sein könnten analysierenTeppich Entdeckung. Trotz der Versprechen, gibt es zwei große Schulden dieser Vorgehensweise, die eine schnelle Entdeckung behindern. Erstens gewinnt rechtzeitigen Zugang zu Tumormaterial für genomische Verhör kann als eine wesentliche Hürde bei der Bewegung von der Therapie zur Heilung dienen. Zum anderen können die Entfaltung der Vielzahl von genetischen Läsionen in der beständigen Einstellung schwierig sein, da Tumoren signifikant intratumorale Heterogenität 6,7 präsentieren.
Angesichts dieser Herausforderungen hat es auf präklinische Entdeckung von Resistenzmechanismen wurden verstärkt herangezogen. Dieser Ansatz kann Identifizierung von prominenten Resistenzmechanismen vor den klinischen Studien 1, die alternative klinische Managementstrategien bei Patienten, die diese Mechanismen entweder vor der Therapie oder nach dem Einsetzen des Widerstands tragen führen können zulassen.
Eine solche präklinischen Discovery-Tool, das in großem Umfang verwendet wird, ist es, unvoreingenommene funktionelle RNAi-Screens gelten. Für Prüfungsweise Whittaker und Kollegen angewandt eine genomweite RNAi-Bildschirm zu erkennen, dass NF1 Verlust vermittelt Resistenz gegen RAF und MEK-Inhibitoren durch nachhaltige MAPK Signalweg-Aktivierung 8. Diese Ergebnisse wurden gefunden, um klinisch relevant wie loss-of-function Mutationen im NF1 wurden in BRAF -Mutante Tumorzellen, die intrinsisch resistent gegen RAF-Hemmung und in Melanomtumoren beständig Aktivierung 8 Vemurafenib sind beobachtet. Trotz des Erfolgs dieser Ansatz vielen klinisch relevanten Ziele werden häufig nicht identifiziert, vermutlich aufgrund der Loss-of-function-Vorspannung dieses Ansatzes.
Im Gegensatz dazu ist eine weniger voreingenommen Werkzeug für präklinische Entdeckung von Resistenzmechanismen beinhaltet die Erzeugung von resistenten Zelllinien bei längerer Exposition gegenüber Verbindung von Interesse verbunden mit NGS-basierte genomische oder Transkriptom-Profiling. Dieser Ansatz wurde von mehreren Gruppen durchgeführt, um zu ermitteln spontanewiederkehrende Einzel-Nukleotid-Varianten oder Ausdruck Veränderungen, die Widerstands 5,9,10 zu ermöglichen. Zum Beispiel wurde ein wiederkehrendes F876L Mutation AR kürzlich resistente Klone in vitro 3-5 und in Xenotransplantat-Tumoren in vivo 5 vor der Identifizierung der Mutation in der Klinik 4 entdeckt. Erst kürzlich Bhang und Kollegen (2015) 11 in zwei klinisch relevanten Modellen verwendet ClonTracer, dass Mehrheit der resistente Klone, die während der verlängerten Arzneimittelexposition entstehen, waren Teil einer bereits bestehenden Subpopulation darauf hindeutet, dass die meisten funktionell relevante Mutationen zeigen, sind wahrscheinlich bereits vorbestehenden dass geworden für die bei der Auswahl 11 ausgewählt.
Im Gegensatz zu der genomischen Profilierungs von Tumoren früher diskutiert, dieser Ansatz wird zudem weniger Heterogenität als "homogene" resistente Klone werden zur Analyse verwendet Erleichterung genauer Genetik der potentielle Fahrer. FurthermErz, aufregend, zusätzlich zu dem Potential für die Aufdeckung Resistenzmechanismen, kann dieses Verfahren auch angewendet werden, um die zellulären Mechanismen der Wirkung und Targets von bioaktiven kleinen Molekülen für die diese Information nicht bekannt ist 10 identifizieren. Angesichts der klaren Vorteile und die Mehrfachnutzung von diesem Ansatz, hier präsentieren wir ein Protokoll Detaillierung erfolgreiche Umsetzung eines solchen präklinischen Bildschirm, um das Potential für klinisch bedeutsame Entdeckungen zu maximieren.
Auswahl der Zelllinie (n): Charakterisierung des genetischen Zustand und genomische Instabilität
Zweifellos ist die absolut wichtigste Faktor bei der erfolgreichen Aufdeckung klinisch relevanter Resistenzmechanismen der ursprüngliche Zelllinie Auswahl. Zwei Faktoren berücksichtigt werden sollten. Zunächst wollen Zelllinie (n) des gleichen Linie / Subtyp beherbergen die definierenden genetischen Merkmalen der Krankheit zu wählen (z. B. BRAF V600E in Melanom). Abfrage der öffentlich verfügbaren transkriptomischen und Mutationsdaten für beide Zellinien 30-32 und primär / Metastasierung von Tumoren für eine Vielzahl von Indikationen 33,34 wird die Auswahl zu erleichtern. Obwohl Identifizierung von Zelllinien mit klinisch relevanten genetischen Veränderungen eignet, in einigen Fällen kann dies nicht möglich sein, aufgrund des Fehlens von verfügbaren Zellinien oder durchführbar aufgrund von Faktoren, wie die Schwierigkeit und die Länge des Screening-Prozesses.
<p class="jove_content"> Im Hinblick auf die zuvor genannten Punkt einen zweiten Faktor, der dann während der Zelllinienauswahl prüfen, ist die Leichtigkeit oder Durchführbarkeit Widerstand Screening mit der gewünschten Linie. So kann beispielsweise Faktoren wie Proliferation und intrinsische Mutationsraten einen enormen Einfluss auf die Geschwindigkeit der Entdeckung. Zu diesem Zweck können Zelllinien mit einem schnelleren Wachstum Kinetik und mangelhaft in DNA MMR Mechanismen in der Hoffnung verwendet, dass Entstehung spontaner Widerstand beschleunigt 35 werden. Basierend auf der kosmischen Datenbank gibt es mehrere Kandidaten-Zellinien mit einem Mangel in einer der zwei häufigsten mutierte MMR-Gene, MSH2 und MLH1 (Tabellen 2 und 3). Alternativ, wenn Zelllinien von Interesse nicht Lagerdefekte bestehen in MMR, akute Behandlung mit physikalischen oder chemischen Mutagenen DNA reaktive wie Alkylierungsmittel N-Ethyl-N -nitrosourea (ENU) verwendet, um genomische Instabilität verstärken. Obwohl beide Ansätze erheblich sHORTEN die Zeit, um resistente Klone erreichen und Nachbereitung Sequenzierung Stringente funktionellen Tests auf Kandidatengenen als eine größere Anzahl von nicht-funktionellen durchgeführt werden, sind Passagier Mutationen wahrscheinlich austreten. SNVs können Rangordnung, um die Chancen für die Identifizierung funktionell relevante Mutationen zu maximieren. Erstens, die Wahl diese Mutationen, die in unabhängigen Klonen wiederkehrende werden die Wahrscheinlichkeit, diese Mutationen sind Fahrer von Widerstand zu erhöhen. Im Falle wiederholten Mutationen nicht identifiziert werden, die sich auf SNVs dass der Mechanismus der Wirkung des Arzneimittels zu passen (beispielsweise das Target oder eine bekannte nachgeschalteten Effektor des Target) kann sinnvoll sein. Letztlich ist der Goldstandard immer experimentelle Evaluierung der verleih Aktivität der Kandidaten SNVs von Eileiter cDNA-Expression in Drogenempfindlichen Elternzellen.DNA vs RNA-Sequenzierung
Sobald resistenten Klonen erzeugt wurden, DNA und / oder RNAkönnen je nach Bedarf sequenziert werden. DNA-Sequenzierung, entweder Exoms oder Vollgenomsequenzierung, wird Identifizierung der Keimbahn und somatischen Varianten, wie SNPs, indels ermöglichen und Nummer des Exemplars Varianten. Während die kostenfreundlich Exoms Sequenzierung konzentriert sich auf die Erzeugungs liest aus bekannten kodierenden Regionen, werden Gesamtgenom-Sequenzierung Daten für das gesamte Genom, die die Identifizierung von Mutationen in nicht-codierenden Elemente, wie Enhancer oder miRNAs 36 zu erleichtern, kann zu erzeugen. Da Genexpressionsdaten nicht während der DNA-Sequenzierung gemessen, ist es jedoch schwierig, die Mutation (en) wahrscheinlich eine funktionelle Fahrer vorherzusagen. In dieser Hinsicht ist die Sequenzierung von RNA, obwohl teurer, bietet diesen Vorteil. Die Tatsache, dass eine Mutation aufruf nur auf exprimierten RNA-Spezies durchgeführt erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass die Mutation von Interesse kann ein Funktionstreiber. Darüber hinaus ermöglicht eine gezieltere Befragung von Mutationen für Follow-up-Funktionstests, RNA-Sequenzierung auchbietet den zusätzlichen Vorteil, dass die Genexpression Veränderungen, alternative Spleißen und neuen chimären RNA-Spezies, einschließlich von Genfusionen, die auch als potente Fahrer Widerstand dienen kann, zu identifizieren.
Bioinformatik Pipeline
Beispiel Befehle werden zu Illustrationszwecken zur Verfügung gestellt, aber ausführlichere Dokumentation und Tutorials sind vom Broad Institute zur Verfügung 16 und sollte gründlich vor Beginn NGS Analyse gelesen werden. Die folgenden Befehle werden für eine UNIX-Shell-Umgebung auf einem System, auf dem alle Tools und Referenzdaten haben vorinstalliert konzipiert. Diese Befehle auch davon ausgehen, fastq Dateien mit Paired-End-Sequenz liest von zwei Proben mit dem Namen "Eltern" und "resistent", haben Sie vom Anbieter eingegangen ist und sich im Verzeichnis "data" gesetzt. In den meisten Fällen sollten diese Befehle angepasst oder für eine bestimmte Anwendung, wobei Sie zusätzliche Befehlszeilen arg optimiert werdenkumente (zB das Hinzufügen "-t 8" auf den Befehl BWA ermöglicht Multithread-Betrieb über 8 CPU-Kerne). Lesegruppen (die Ausrichtungen, um biologische Proben zuzuordnen), müssen oft mit BAM-Dateien hinzugefügt werden, selbst wenn es nur eine Probe pro bam-Datei, um mit der Dateiformatanforderungen für bestimmte Werkzeuge entsprechen. Lesen Sie Gruppenparameter RGID, RGSM, RGPL, RGPU und RGLB können beliebige Zeichenfolgen den Beispielnamen beschreiben, Sequenzierung Plattform und Bibliothek-Strategie sein.
In-vitro-vs in vivo-Assays
Obwohl mehrere Resistenzmechanismen durch in vitro Selektion identifiziert wurden überprüft, um klinisch relevant, gibt es eine Möglichkeit, dass die Mechanismen können nicht als relevant oder überwiegende Mechanismen der klinischen Beständigkeit dienen. Ein Grund dafür kann eine wesentliche Rolle für die Mikroumgebung in Fahrwiderstand auf die Therapie, eine Komponente, die frei in dem Versuchsprotokoll / setup d umfassenbisher iscussed. Tatsächlich haben verschiedene Studien gezeigt, dass die Antikrebsmittel, die in der Lage sind, Tumorzellen zu töten unwirksam werden, wenn die Tumorzellen in Anwesenheit von Stromazellen impliziert angeborenen Resistenzmechanismen von Stroma 37,38 tragenen kultiviert werden. Um solche Stroma induzierte erworbenen Resistenzmechanismen zu identifizieren, kann man erwägen die Durchführung in vitro Co-Kultur oder in vivo Tumorresistenz Assays. Da erstere Assay ist ziemlich komplex, haben viele der Erzeugung von arzneimittelresistenten Tumor-Xenotransplantaten auf die potentielle Rolle des Stromas in Fahrwiderstand ansprechen gegriffen. Solche Studien beide identisch 5 und einzigartige 39 Resistenzmechanismen relativ zur in vitro-Selektion freigelegt, was bedeutet, dass das Stroma kann tatsächlich eine Rolle bei der letzteren spielen. Allerdings ist ein eingedenk der Länge der Zeit kann es zu ergreifen, um solche resistenten Tumoren zu erzeugen, und der Komplexität des Follow-up der Genomanalyse-complexitie sein müssens durch die intratumorale molekularen und zellulären Heterogenität.
Zielidentifizierung
Neben der Aufdeckung von Drogenresistenzmechanismen, kann dies NGS-basierte Genomprofilansatz auch angewendet werden, um zelluläre Ziele chemischer Sonden zu identifizieren. Historisch gesehen, mehrere unvoreingenommene Verfahren verwendet worden, um die zellulären Wirkmechanismen und Ziele der niedermolekularen Chemie mit biologischen Aktivitäten, einschließlich Affinitätsreinigung in Verbindung mit der quantitativen Proteomik, Hefe genomische Methoden, RNAi-Screening und Rechen Inferenz Ansätze 40 zu identifizieren. Als Erweiterung zum Aufklärung der Medikamentenresistenz-Mechanismen mit NGS-basierte genomische oder transkriptomischen Profilierung phänotypisch resistenten Zellpopulationen, die Identifizierung von einzigartigen wiederkehrenden Einzel-Nukleotid-Variationen (SNVs) oder Expression Veränderungen, die Widerstands aktivieren können Einblicke in die Funktions zellulären Ziele von Verbindungen bieten. Tsein basiert auf der Idee, dass ein Teil der beobachteten Widerstandsmechanismen rezidivierenden Mutationen in Genen, die die direkte Proteinziele des kleinen Moleküls kodieren behaftet sind. Vor kurzem validiert mehrere Berichte die Nützlichkeit des Ansatzes, vor allem durch die Kombination mit anderen Ansätzen, einschließlich Großkrebszelllinie Empfindlichkeit Profiling, um enthüllt die zellulären Ziele niedermolekularer Sonden 9,10.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.
48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | Expanding clones |
96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-588 | Generating GI50 curves |
CellTiter-Glo | Promega | G7572 | Viability testing |
Cloning discs (3 mm) | Sigma | Z374431 | Picking clones |
Sterile forceps | Unomedical | DF8088S | Picking clones |
RNeasy Plus RNA extraction kit | Qiagen | 74134 | Isolating RNA |
Blood and Tissue DNeasy extraction kit | Qiagen | 69581 | Isolating gDNA |
GATK | The Broad Institute | Indel realigner | |
MuTect | The Broad Institute | Paired variant calling tool | |
Oncotator | The Broad Institute | Variant annotation tool | |
MutationAccessor | The Broad Institute | Functional impact prediction tool |