La resistenza ai farmaci per terapie mirate è molto diffusa e la necessità di individuare meccanismi di resistenza – prima o dopo l'insorgenza clinica – è fondamentale per guidare le strategie alternative di gestione clinica. Qui, presentiamo un protocollo per accoppiare derivazione di linee farmaco-resistenti in vitro con sequenziamento per accelerare scoperta di questi meccanismi.
Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.
Caratterizzazione molecolare dettagliata dei genomi tumorali di tecnologie di sequenziamento robuste e strumenti analitici migliorata dati ha portato alla scoperta di alterazioni genetiche chiave per specifici tipi di cancro 1,2. Sviluppo di terapie mirate per queste lesioni genetiche, come l'HER2, BCR-ABL, EGFR e ALK, hanno notevolmente migliorato la qualità di vita dei pazienti 1,2. Tuttavia, nonostante la specificità di questo approccio, la risposta clinica alla maggior parte delle terapie singole è stato sub-ottimale come resistenza emerge in definitiva. Recentemente, sono stati compiuti progressi significativi nella comprensione delle basi molecolari di resistenza a terapie mirate. Curiosamente, sta diventando evidente che un meccanismo di spicco della resistenza comporta persistente attività di destinazione / percorso. Come un caso in questione, il recettore degli androgeni (AR) -directed trattamento enzalutamide del cancro alla prostata porta ad un arricchimento di attivare mutazioni nel AR sé, mantenendo-AR segnalazione output in presenza dell'inibitore 3-5. Questa conoscenza ha portato ad una campagna aggressiva per 1) sviluppare antagonisti di terza generazione che possono continuare a sopprimere sia WT e la funzione mutante-AR in enzalutamide resistenti PCa 3 e 2) identificare potenziali nodi a valle della segnalazione AR che possono essere mirati per intervento terapeutico . Allo stesso modo, la resistenza ad altre classi di inibitori come quelli di targeting EGFR, BRAF e ABL spesso portano a mutazioni che riattivano l'originale avvincente chinasi 1.
Con la consapevolezza che la resistenza emerge inevitabilmente maggior parte dei pazienti, sviluppare approcci per portare rapidamente questi meccanismi alla luce permetterà lo sviluppo di terapie di follow-up efficaci. Un approccio che viene ampiamente utilizzato è quello di analizzare la genomica dei tumori refrattari clinici relativi a tumori non pretrattati o sensitive per identificare arricchimenti / esaurimento nelle lesioni genetiche che possono essere suscettibili di dscoperta tappeto. Nonostante la sua promessa, ci sono due principali responsabilità di questo approccio che ostacolano la scoperta rapida. In primo luogo, l'accesso tempestivo a materiale tumorale per l'interrogatorio genomica può servire come un ostacolo significativo nel passaggio da una terapia per curare. In secondo luogo, deconvoluzione della miriade di lesioni genetiche in ambito resistente può essere difficile dato che i tumori possono presentare significative intra-tumorale eterogeneità 6,7.
Alla luce di queste sfide, c'è stato un aumento dipendenza scoperta preclinico di meccanismi di resistenza. Questo approccio può consentire l'identificazione di meccanismi di resistenza importanti prima degli studi clinici 1 che possono guidare le strategie di gestione clinica alternative in quei pazienti che portano questi meccanismi sia prima della terapia oa seguito di insorgenza di resistenza.
Uno di questi strumenti scoperta preclinica che viene ampiamente utilizzato è quello di applicare imparziali schermi RNAi funzionali. Per l'esamepio, Whittaker e colleghi hanno applicato uno schermo RNAi genoma scala per identificare che la perdita di NF1 media resistenza agli inibitori della RAF e MEK attraverso MAPK pathway di attivazione sostenuta 8. Questi risultati sono stati trovati per essere clinicamente rilevante come la perdita-di-funzione mutazioni in NF1 sono stati osservati in BRAF cellule tumorali -mutant che sono intrinsecamente resistenti alla inibizione RAF e nei tumori melanoma resistenti a vemurafenib attivazione 8. Tuttavia, nonostante il successo di questo approccio, molti obiettivi di rilevanza clinica sono spesso non identificati, probabilmente a causa dei pregiudizi perdita-di-funzione di questo approccio.
Per contro, uno strumento meno parziale per la scoperta preclinica di meccanismi di resistenza comporta la generazione di linee cellulari resistenti di esposizione prolungata a composti di interesse accoppiato con base-NGS profilo genomico o transcriptomic. Questo approccio è stato implementato con successo da diversi gruppi per identificare spontanearicorrenti varianti nucleotide o espressione alterazioni singole che consentono la resistenza 5,9,10. Ad esempio, una mutazione F876L ricorrente in AR è stato recentemente scoperto in cloni resistenti in vitro 3-5 e nei tumori xenotrapianto in vivo 5 prima di identificazione di questa mutazione nella clinica 4. Molto recentemente, Bhang e colleghi (2015) 11 usato ClonTracer in due modelli clinicamente rilevanti per dimostrare che la maggior parte dei cloni resistenti che si presentano durante l'esposizione prolungata del farmaco facevano parte di un pre-esistente sottopopolazione suggerendo che più funzionalmente rilevanti mutazioni sono probabilmente già preesistente che diventano selezionati per durante la selezione 11.
In contrasto con il profilo genomico di tumori discussi precedentemente, questo approccio beneficia meno eterogeneità cloni resistenti "omogenei sono usati per l'analisi genetica facilitare la dissezione più accurata dei potenziali conducenti. Furthermminerale, eccitante, oltre alla possibilità di scoprire meccanismi di resistenza, questo metodo può essere applicato anche per identificare i meccanismi cellulari di azione e obiettivi di piccole molecole bioattive per cui questa informazione è sconosciuta 10. Dati i chiari vantaggi e le molteplici usi di questo approccio, qui vi presentiamo un protocollo dettagliato successo di un tale schermo preclinico per massimizzare il potenziale di scoperte clinicamente significativi.
Selezione della linea di cellule (s): Caratterizzazione dello stato genetico e instabilità genomica
Senza dubbio, il fattore più importante nello scoprire con successo clinicamente rilevanti meccanismi di resistenza è la selezione iniziale linea cellulare. Due fattori devono essere considerati. In primo luogo, l'obiettivo di selezionare la riga cellulare (s) dello stesso lignaggio / sottotipo ospitare i tratti genetici che definiscono della malattia (ad es., BRAF V600E nel melanoma). Interrogatorio di dati pubblicamente disponibili trascrittomica e mutazione per entrambe le linee di cellule 30-32 e tumori primari / metastasi per una serie di indicazioni 33,34 faciliterà il processo di selezione. Sebbene l'identificazione di linee cellulari con clinicamente rilevanti alterazioni genetiche è ideale, in alcuni casi questo può non essere possibile a causa della mancanza di linee cellulari disponibili o fattibile a causa di fattori come la difficoltà e la lunghezza del processo di screening.
<p class="jove_content"> Per quanto riguarda il punto di cui sopra, un secondo fattore da considerare poi durante la selezione della linea cellulare è la facilità o la fattibilità della resistenza screening utilizzando la linea desiderata. Per esempio, fattori quali la proliferazione e tassi di mutazione intrinseci possono influire notevolmente sulla velocità di scoperta. A tal fine, le linee cellulari possono essere utilizzati con cinetica di crescita più veloci e carente nei meccanismi MMR DNA nella speranza che emergere della resistenza spontanea può essere accelerata 35. Sulla base del database di COSMIC, esistono diverse linee cellulari candidato con deficit in uno dei due geni mutati spesso MMR, MSH2 o MLH1 (Tabelle 2 e 3). In alternativa, se non esistono linee di cellule di interesse difetti tenendo MMR, trattamento acuto con mutageni chimici o fisici DNA reattivi come l'agente alchilante N -ethyl- N -nitrosourea (ENU) può essere utilizzato per migliorare instabilità genomica. Sebbene entrambi gli approcci possono s in modo significativoHorten il tempo per ottenere cloni resistenti e follow-up di sequenziamento, test funzionali rigorosi dovrebbe essere eseguita su geni candidati come un maggior numero di non-funzionale, le mutazioni passeggeri rischiano di emergere. SNVs può essere rango ordinato di massimizzare le possibilità per l'identificazione di mutazioni funzionalmente rilevanti. In primo luogo, la scelta di quelle mutazioni che sono ricorrenti nei cloni indipendenti aumenterà la probabilità che queste mutazioni sono i driver di resistenza. Nel caso ricorrenti mutazioni non sono identificate, concentrandosi su SNVs che si adattano il meccanismo di azione del farmaco (per esempio, il bersaglio farmaco o un effettore noto valle del bersaglio di farmaci) possono essere significative. In ultima analisi, il gold standard è sempre valutazione sperimentale di attività di resistenza-conferimento dei SNVs candidati di espressione cDNA ectopica nelle cellule parentali droga sensibili.DNA vs RNA sequenziamento
Una volta cloni resistenti sono stati generati, DNA e / o RNApuò essere sequenziato a seconda della necessità. Sequenziamento del DNA, o exome o tutto il sequenziamento del genoma, consentirà l'identificazione di linea germinale e somatici varianti, come SNPs, indels e numero di esemplari varianti. Considerando che il rapporto costo-amichevole sequenziamento dell'esoma concentra sulla generazione di legge da regioni codificanti note, tutto il sequenziamento del genoma genererà dati di sequenziamento per l'intero genoma, che possono facilitare l'identificazione delle mutazioni in elementi non codificanti, come esaltatori o miRNA 36. Tuttavia, poiché i dati di espressione genica non è misurato durante il sequenziamento del DNA, è difficile prevedere quale mutazione (s) è probabile che sia un driver funzionale. A questo proposito, la sequenza di RNA, quanto più costosi, offre questo vantaggio. Il fatto che la mutazione chiamante viene eseguita solo su specie di RNA espressi aumenta la probabilità che la mutazione di interesse può essere un driver funzionale. Oltre a consentire un sondaggio più mirato di mutazioni per i test funzionali di follow-up, l'RNA sequenza ancheoffre il vantaggio di essere in grado di identificare le alterazioni del gene di espressione, lo splicing alternativo e nuove specie di RNA chimerici, tra cui fusioni geniche che possono anche servire come potenti fattori di resistenza.
Bioinformatica gasdotto
Comandi di esempio sono forniti a scopo illustrativo, ma la documentazione più dettagliata e tutorial sono disponibili presso il Broad Institute 16 e devono essere letti attentamente prima di iniziare l'analisi NGS. I seguenti comandi sono progettati per un ambiente di shell UNIX su un sistema su cui sono pre-installati tutti gli strumenti ei dati di riferimento. Questi comandi presuppongono anche file FASTQ contenente sequenza accoppiato-end legge da due campioni, il nome di "genitori" e "resistente", sono stati ricevuti dal fornitore e inserito nella directory "data". Nella maggior parte dei casi questi comandi devono essere adattati o ottimizzati per una specifica applicazione utilizzando aggiuntivo di argomenti da riga di comandocumenti (ad esempio, l'aggiunta di "-t 8" al comando BWA permette il funzionamento multithreaded su 8 core CPU). Gruppi di lettura (che assegnano allineamenti di campioni biologici), spesso devono essere aggiunte ai file BAM anche se vi è un solo campione per file bam, al fine di soddisfare i requisiti di formato di file per alcuni strumenti. Leggi parametri del gruppo rgid, RGSM, RGPL, RGPU, e RGLB può essere stringhe arbitrarie che descrivono il nome del campione, la piattaforma di sequenziamento, e la strategia biblioteca.
In vitro vs test in vivo
Anche se diversi meccanismi di resistenza individuati dalla selezione in vitro sono stati verificati per essere clinicamente rilevante, esiste la possibilità che i meccanismi non possono servire meccanismi come rilevanti o predominanti di resistenza clinica. Una ragione di ciò può includere un ruolo essenziale per il microambiente in guida resistenza alla terapia, un componente che è privo del protocollo sperimentale / setup discussed finora. Infatti, diversi studi hanno dimostrato che gli agenti anti-cancro che sono in grado di uccidere le cellule tumorali vengono rese inefficaci quando le cellule tumorali sono coltivate in presenza di cellule stromali che implicano meccanismi di resistenza innata conferite dal stroma 37,38. Per identificare questi meccanismi di resistenza acquisita stroma-indotta, si può prendere in considerazione l'esecuzione di co-coltura in vitro o in saggi di resistenza del tumore in vivo. Dal momento che il primo test è abbastanza complesso, molti hanno fatto ricorso a generare xenotrapianti tumorali resistenti ai farmaci per affrontare il potenziale ruolo dello stroma di resistenza all'avanzamento. Tali studi hanno scoperto entrambi identici 5 e 39 uniche meccanismi di resistenza rispetto alla selezione in vitro, il che implica che il stroma può effettivamente giocare un ruolo in quest'ultimo. Tuttavia, si deve essere consapevoli del periodo di tempo ci vorrà per generare tali tumori resistenti e la complessità del follow-up genomica analisi complexities dovute alla eterogeneità molecolare e cellulare intra-tumorale.
Identificazione del target
Oltre a scoprire i meccanismi di resistenza ai farmaci, questo approccio profiling genomico basato NGS può essere applicato anche per identificare bersagli cellulari di sonde chimiche. Storicamente, più metodi imparziali sono stati utilizzati per identificare i meccanismi cellulari di azione e obiettivi di sostanze chimiche a basso peso molecolare con attività biologiche, tra cui la purificazione di affinità accoppiato con la proteomica quantitativa, lievito metodi genomici, lo screening RNAi, e l'inferenza computazionale approcci 40. Come estensione di delucidazione dei meccanismi di farmaco-resistenza con sede a NGS profilo genomico o trascrittomica di popolazioni cellulari fenotipicamente resistenti, l'identificazione di varianti uniche ricorrenti a singolo nucleotide (SNVs) o alterazioni di espressione che consentono di resistenza in grado di offrire approfondimenti obiettivi funzionali cellulari di composti. Tla sua è basato sull'idea che un sottoinsieme di meccanismi di resistenza osservati può comportare ricorrenti mutazioni nei geni che codificano le proteine bersaglio diretti della piccola molecola. Recentemente, diverse segnalazioni convalidato l'utilità del metodo, in particolare combinando con altri approcci, tra cui su larga scala linea di cellule di cancro sensibilità profilatura, a rivelare i bersagli cellulari di piccole molecole sonde 9,10.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.
48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | Expanding clones |
96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-588 | Generating GI50 curves |
CellTiter-Glo | Promega | G7572 | Viability testing |
Cloning discs (3 mm) | Sigma | Z374431 | Picking clones |
Sterile forceps | Unomedical | DF8088S | Picking clones |
RNeasy Plus RNA extraction kit | Qiagen | 74134 | Isolating RNA |
Blood and Tissue DNeasy extraction kit | Qiagen | 69581 | Isolating gDNA |
GATK | The Broad Institute | Indel realigner | |
MuTect | The Broad Institute | Paired variant calling tool | |
Oncotator | The Broad Institute | Variant annotation tool | |
MutationAccessor | The Broad Institute | Functional impact prediction tool |