前または臨床的発症次 – – 標的治療に対する薬剤耐性は広範囲に及び抵抗のメカニズムを同定することが必要である代替臨床管理戦略を導くために重要です。ここでは、これらのメカニズムの発見を促進するためにシークエンシングを用いたin vitro での薬剤耐性株のカップルの導出にプロトコルを提示します。
Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.
堅牢なシーケンシング技術と改良されたデータ分析ツールによる腫瘍ゲノムの詳細な分子特性は、特定の癌の型1,2内のキー遺伝子変異の発見につながりました。そのようなHER2、BCR-ABL、EGFRおよびALKのようなこれらの遺伝子病変を目的とした標的治療薬の開発は、かなりの患者1,2の生活の質を改善しています。抵抗値が最終的に出てくるしかし、この方法の特異性にもかかわらず、ほとんどの単一療法に対する臨床応答は、サブ最適でした。近年、著しい進歩が標的治療に対する耐性の分子的基盤を理解する上でなされました。興味深いことに、それは抵抗の顕著なメカニズムは永続的な目標/経路の活性が関与することが明らかになってきています。その一例として、アンドロゲン受容体(AR)は、前立腺癌のエンザルタミド治療は、AR自体に変異を活性化維持の充実につながる標的としたARシグナルOUTP阻害剤3-5の存在下でのUT。この知識は、1に積極的なキャンペーンにつながっている)エンザルタミド耐性のPCa 3にWTおよび変異AR機能の両方を抑制し続け、2)治療的介入のための標的とすることができるARシグナル伝達の潜在的な下流のノードを識別することができる第三世代のアンタゴニストを開発。同様に、EGFR、BRAFおよびABLを対象としているような阻害剤の他のクラスへの耐性は、多くの場合、元の中毒キナーゼ経路1を再活性化変異につながります。
抵抗は必然的に迅速に光にこれらのメカニズムをもたらすための方法を開発し、多くの患者に現れるという知識と効果的なフォローアップ療法の開発が可能になります。広く使用されている一つの方法は、Dの影響を受けやすいことがあり、遺伝的病変における濃縮度/枯渇を識別するための相対的な治療未経験または感受性腫瘍に対する臨床難治性腫瘍のゲノム解析を分析することですラグ発見。その約束にもかかわらず、迅速な発見を妨げ、このアプローチには2つの主要な債務があります。まず、ゲノムの質問のために腫瘍材料へのタイムリーなアクセスを得るためには、硬化療法が移動する際に重要なハードルとして機能することができます。腫瘍が重要な腫瘍内異質6,7を提示することができるので、第二に、耐性の設定で遺伝子損傷の無数のデコンボリューションは困難な場合があります。
これらの課題を踏まえ、耐性機構の前臨床発見への依存が高まってきました。このアプローチは、従来の治療の前に、または耐性の発現以下のいずれかのこれらのメカニズムを負担した患者における代替臨床管理戦略を案内することができる臨床試験1に著名な耐性機構の同定を可能にすることができます。
広く使用されているそのような前臨床発見ツールは、公正な機能RNAiスクリーニングを適用することです。試験を受験しますPLE、ウィテカーらは、NF1の損失は持続MAPK経路の活性化8を通して、RAFおよびMEK阻害剤に対する抵抗性を媒介することを識別するために、ゲノム規模RNAiスクリーニングを適用しました。これらの知見は、NF1における機能喪失型変異はRAF阻害に対して本質的に耐性であるBRAF -mutant腫瘍細胞および活性化8ベムラフェニブに耐性メラノーマ腫瘍において観察されたように、臨床的に関連することが見出されました。しかし、このアプローチの成功にもかかわらず、多くの臨床的に関連の目標は、多くの場合、おそらくこのアプローチの機能喪失バイアスに、識別されていません。
これとは対照的に、耐性機構の前臨床発見にはあまり偏ったツールは、NGSベースのゲノムやトランスクリプトームプロファイリングと結合された目的の化合物への長期の暴露による耐性細胞株の生成を伴います。このアプローチは、成功した自発的な識別するために、いくつかのグループによって実装されています再発の一塩基変異体または抵抗5,9,10を有効に発現の変化。例えば、ARにおける再発F876L変異は、最近試験管 3-5の前クリニック4でこの変異を同定するためにインビボ5 で異種移植腫瘍における耐性クローンで発見されました。ごく最近、バングら(2015)11は、長期薬物暴露中に発生する耐性クローンの大部分を表示するために、2つの臨床的に関連するモデルでClonTracerを使用し、最も機能的に関連する突然変異は、すでに事前既存の可能性があることを示唆している既存の亜集団の一部でしたそれは選択の11時にす るために選択になります。
前述した腫瘍のゲノムプロファイルとは対照的に、より少ない不均一性から、このアプローチの利点は、「均質」耐性クローンは、潜在的なドライバのより正確な遺伝的解剖を容易に分析するために使用されます。 Furtherm鉱石は、エキサイティングな、抵抗性の機序を解明するための可能性に加えて、この方法はまた、この情報が不明10であるため、生物活性小分子の細胞の作用機序および標的を同定するために適用することができます。明確なこの方法の利点と複数の用途を考えると、ここでは、臨床的に意味の発見の可能性を最大化するために、このような前臨床画面の実装を成功さを詳述するプロトコルを提示します。
細胞株(複数可)の選択:遺伝的状態とゲノム不安定性の特徴付け
確かに、首尾よく臨床的に関連する耐性機序の解明において単一の最も重要な要因は、最初の細胞株の選択があります。二つの要因が考慮されるべきです。まず、病気の定義遺伝形質を保有する同系統/サブタイプの細胞株(複数可)を選択することを目指して( 例えば 、黒色腫におけるBRAF V600E)。適応症33,34の様々な両方の細胞株30-32とプライマリ/転移腫瘍に対する公開さトランスクリプトームおよび変異データの尋問は、選択プロセスを容易にします。臨床的に関連する遺伝子変異を有する細胞株の同定は、いくつかの例では、理想的であるが、これは、このようなスクリーニング方法の難しさや長さなどの要因に利用可能な細胞株または可能性の欠如のために可能ではないかもしれません。
<p class="jove_content">上記の点に関しては、細胞株の選択時に、次に考慮すべき第二の要因は、抵抗値が所望の線を用いたスクリーニングのしやすさや実現可能性です。例えば、このような増殖及び固有突然変異率などの要因が大幅発見の速度に影響を与えることができます。この目的のために、細胞株は、自然発生的な耐性の出現35を加速することができることを期待して、DNA MMR機構における速い増殖速度および欠損して利用することができます。 COSMICデータベースに基づいて、いくつかの候補の細胞株は、二つの頻繁に変異したMMR遺伝子の一つ、MSH2もしくはMLH1( 表2および3)に欠陥が存在します。あるいは、目的の細胞株は、このようなアルキル化剤のような物理的またはDNA反応性化学変異原でMMR、急性治療において軸受欠陥が存在しない場合はN -エチル- Nの -nitrosourea(ENU)はゲノム不安定性を増強するために使用することができます。両方のアプローチは、S大幅かもしれないが耐性クローンを達成し、フォローアップシーケンシングをする時間をホルテン、厳しい機能試験は、非機能、より多くのように候補遺伝子で実行する必要があり、乗客の変異が出現する可能性があります。 SNVsは、機能的に関連する変異を同定するための機会を最大化するように命じランクすることができます。まず、独立したクローンで再発されているものの変異を選択すると、これらの変異は、抵抗のドライバです可能性が増加します。イベントに反復突然変異が同定されていない、薬剤の作用機序に合わせSNVsに着目し(例えば、薬物標的または薬物標的の既知の下流エフェクター)が有意義であり得ます。最終的には、金の標準は常に薬剤感受性親細胞における異所性cDNA発現によって候補SNVsの抵抗性付与活性の実験的な評価です。RNA配列決定の対のDNA
耐性クローンを、DNAおよび/またはRNAを生成した後必要に応じて配列決定することができます。 DNA配列決定、exomeまたは全ゲノムシーケンシングのいずれかが、生殖細胞系列などのSNP、インデルとコピー数変異体細胞変異体の同定を可能にします。よりコストに優しいexomeシーケンシングは、生成に焦点を当てているのに対して、既知のコード領域から読み込み、全ゲノムシーケンシングは、エンハンサーまたはmiRNAの36のような非コード要素に変異の同定を容易にすることができるゲノム全体のための配列データを生成します。遺伝子発現データは、DNA配列決定の間に測られていないので、それは機能的なドライバである可能性がある突然変異(単数または複数)を予測することは困難です。この点で、RNAの配列決定は、より高価なものの、この利点を提供しています。突然変異通話のみ発現されるRNA種に実行されるという事実は、目的の変異が機能ドライバとすることができる可能性を高めます。フォローアップ機能テストのための突然変異のより集中調査を可能にすることに加えて、RNA配列決定もまた、抵抗の強力なドライバを果たすことができる遺伝子融合を含む遺伝子発現の変化、選択的スプライシングおよび新規なキメラRNA種を同定することができるという追加の利点を提供しています。
バイオインフォマティクスパイプライン
例のコマンドは、説明のために提供されているが、より詳細なドキュメントやチュートリアルは研究所16ブロードから入手可能であり、NGS解析を開始する前に、徹底的に読まれるべきです。次のコマンドは、すべてのツールと参照データがプリインストールされているシステム上のUNIXシェル環境用に設計されています。これらのコマンドは、FASTQファイルを含むペアエンドシーケンスは、「親」と「耐性」ベンダーから受信した「データ」ディレクトリに配置されているという名前の、二つの試料からの読み取りを想定しています。ほとんどの場合、これらのコマンドは、適応するか、追加のコマンドライン引数を使用して、特定のアプリケーション用に最適化uments(例えば、BWAコマンドに「-t 8」を追加すると8のCPUコア全体でマルチスレッド動作が可能になります)。 BAMファイルごとに1つだけのサンプルが特定のツールのファイル形式の要件に準拠するために、存在したとしても(生物学的サンプルにアラインメントを割り当てる)リードグループは、多くの場合、BAMファイルに追加する必要があります。グループパラメータRGID、RGSM、RGPL、RGPUを読み、RGLBは、任意のサンプル名を表す文字列、シーケンシングプラットフォーム、およびライブラリ戦略することができます。
in vitroでの対インビボのアッセイ
インビトロ選択により同定いくつかの耐性機構を臨床的に関連することが確認されているが、メカニズムが臨床的耐性の関連又は優勢なメカニズムとして機能しない可能性が存在します。この理由の一つは、治療に対する耐性を駆動における微小環境のために必須の役割、実験プロトコル/セットアップdの欠けている成分を含んでいてもよいですこれまでiscussed。実際、いくつかの研究は、腫瘍細胞が間質37,38によって与えられる抵抗の先天的なメカニズムを示唆している間質細胞の存在下で培養した場合、腫瘍細胞を死滅させることができる抗がん剤が無効にされていることを示しています。そのような間質誘導性の獲得抵抗性のメカニズムを同定するために、in vitroでの共培養またはインビボ腫瘍の耐性アッセイでの実行を検討することができます。前者アッセイは非常に複雑であるため、多くの人が抵抗を運転中に間質の潜在的な役割に対処するための薬剤耐性腫瘍異種移植片を生成するに頼ってきました。このような研究は、間質は確かに後者において役割を果たし得ることを示唆し、in vitroでの選択に対する抵抗の両方に同一5とユニークな39のメカニズムを明らかにしました。しかし、人はそのような耐性腫瘍を発生させるために取ることができる時間の長さとフォローアップゲノム解析-complexitieの複雑さを意識なければなりません腫瘍内の分子や細胞の不均一に起因するの。
目標識別
薬剤耐性のメカニズムを解明することに加えて、このNGSベースのゲノムプロファイリングのアプローチは、化学プローブの細胞標的を同定するために適用することができます。歴史的には、複数の公平な方法は、定量的プロテオミクスに結合されたアフィニティー精製、酵母ゲノムの方法のRNAiスクリーニング、および計算推論40に近づく含む生物学的活性を有する低分子量化学物質の細胞の作用機序および標的を同定するために使用されています。表現型耐性細胞集団のNGSベースのゲノムやトランスクリプトームプロファイリングを使用して、薬剤耐性機構の解明の拡張として、独特の再発一塩基変異(SNVs)または抵抗を可能にする発現変化の識別は、化合物の機能的な細胞標的への洞察を提供することができます。 T彼が観察耐性メカニズムのサブセットは、小分子の直接の標的タンパク質をコードする遺伝子内の反復性の変異を含むことができるという考えに基づいています。最近、いくつかの報告は、特に小分子プローブ9,10の細胞標的を明らかにするために、プロファイリング大規模な癌細胞株の感受性などの他のアプローチと組み合わせて、アプローチの有用性を検証しました。
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.
48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | Expanding clones |
96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-588 | Generating GI50 curves |
CellTiter-Glo | Promega | G7572 | Viability testing |
Cloning discs (3 mm) | Sigma | Z374431 | Picking clones |
Sterile forceps | Unomedical | DF8088S | Picking clones |
RNeasy Plus RNA extraction kit | Qiagen | 74134 | Isolating RNA |
Blood and Tissue DNeasy extraction kit | Qiagen | 69581 | Isolating gDNA |
GATK | The Broad Institute | Indel realigner | |
MuTect | The Broad Institute | Paired variant calling tool | |
Oncotator | The Broad Institute | Variant annotation tool | |
MutationAccessor | The Broad Institute | Functional impact prediction tool |