Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.
The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.
Bu doğal sitozin metilasyonu 1 şeklinde DNA değişiklikleri meydana gelen ilk rapordan bu yana yarım yüzyıl boyunca olmuştur. Sitozin metilasyonu taban halkası üzerinde 5 inci karbon bir metil grubu (5-mC), en sık memeli genomları CpG dinükleotid motifi meydana sahip bir modifiye sitozin nükleotid temelidir. yokluğu transkripsiyon aktivitesi 2 ile bağlantılı iken gen promoteri 5-Mc fonksiyonel mevcudiyeti genellikle, transkripsiyon baskı ile ilişkilidir.
Muazzam gelişmeler geliştirme 3 DNA metilasyon, epigenetik profiller 4, kanser patogenezi 5,6, ve diğer araştırma alanlarında sayısı transgeneration yayılma rolü anlayışımız yapılmıştır. Yeni yöntemler, DNA metilasyonu 7 profile geliştirilmiştir gibi bu ilerlemelerin çoğu son birkaç yıl içinde gelmiş. Gelişine veYeni nesil sekanslama (NGS) teknikleri yaygınlaşması hemen tüm genom ya da genom 8 geniş kısımlarının karşı DNA metilasyonu profil için bir dizi yöntem mevcuttur. Bu yaklaşımlar, DNA metilasyon desen ve DNA metilasyonu farklılıkları ölçmek keşif çalışmalarının olasılığını açın. Bu hipotez üreten yaklaşımlara ek olarak, hedef / hipotez testi DNA metilasyonu niceleme yöntemleri için önemli bir ihtiyaç vardır.
Pyrosequencing, metilasyon spesifik PCR ve bisülfit dönüştürülmüş DNA'nın doğrudan Sanger sıralama hedeflenen bölgelerin analizi için en çok kullanılan yöntemler olmuştur (yani, tek bir genin bir promotör bölgesi veya CpG ada) 9-12. Metillenmiş sitozin bozulmamış 13,14 devam ederken, bu yöntemlerin tümü, bisülfit dönüşümü, metillenmemiş sitozin en urasil en dönüştürülür kimyasal deaminasyon reaksiyona dayanır. Bisulfite- PCR amplifikasyonudiferansiyel metilasyonu temel farkı olarak okumak için izin timin 15 urasil yılların yerine dönüştürülmüş DNA sonuçları. Yüksek ölçüde yararlı ise de, bu yöntemlere sınırlamalar düşük sayısal hassasiyeti, kısa okuma süresi ve düşük numune sayısını içerir. Bu sınırlamaları gidermek için biz (BSAS) 16 bisülfit Amplikon Sıralama adlandırdığımız bir yöntem geliştirdi. Bu yöntemin hedefi, yüksek sayısal hassasiyetle örneklerin çok sayıda ilgi konusu hedef genomik bölge analiz edebilmek için.
BSAS mevcut metodların elemanları (bisülfit dönüşümü ve bölgeye özgü PCR) kullanan ve basit nesil kütüphane yapısı (transposome aracılı) 17 ve tezgah üstü NGS 18 (Şekil 1) ile bir araya getirmektedir. Bu yaklaşım, söz konusu herhangi bir bölgede sitozin metilasyonu incelemek için daha nicel ve daha yüksek verimli bir yöntem temin etmektedir. Burada sunduğumuzdetaylı yöntem ve sorun giderme ve kalite BSAS sürecini kontrol etmek için yaklaşımlar tarif.
BSAS örnekler ve hedeflerin sayısı, her iki dizi, yüksek ölçüde yetenekleri ile odaklanmış doğru DNA metilasyonu kantitatif sağlar. Ayrıca, transposome-aracılı tagmentation kullanarak bu kütüphane nesil hızlı, daha az girdi DNA olduğunu gerektirir ve geleneksel kesme ve sonraki adaptör ligasyonu teknikleri daha az adımları içerir. Mevcut yöntemlere göre bu gelişmeler söz konusu herhangi bir hedef alanının taban düzeyinde bir DNA metilasyon analizi için izin verir. Ayrıca, BSAS tüm genom bisülfit 22 veya yakalamak 23 yaklaşımlar kullanılarak tespit edilmiştir ilgi alanlarının (farklı olarak metilasyon bölgeleri (DMRs), CpG adaları, düzenleyici bölgeler) teyidi için yeni bir yöntem sağlamaktadır. Ortogonal onay yaklaşımları ve daha nicel yöntemler kullanarak kesin Epigenomic çalışmaların analitik titizlik geliştirir. BSAS ile elde edilen yüksek okuma derinliği yeniden, dar bir güven aralığı doğru kantitatif için izin verirhassas kantitatif 16 engellenmesi hususundaki. Ayrıca, tek bir deneyde birçok örnekleri çalıştırmak için yeteneği istatistiksel gücünü artıracak tüm genom yöntemleri teyitleri, örnek boyutunu artırabilirsiniz; Birçok akım epigenetik çalışmalar zayıflık. Önemli olarak, BSAS epigenetik araştırmalar için test edilebilir hipotez oluşumu için izin veren bir baza spesifik CpG metilasyon nicelendirilmesine içerir. Örneğin, belirli bir tepki elemanı artış metillenmesi hipotezler azalmış bir transkripsiyon faktörü bağlanma neden olur. Eşleştirilmiş mRNA ekspresyon verileri ile kombine BSAS, doku ya da hücre popülasyonunda tek bir parça içinde epigenetik düzenleme ve mRNA hem elde edilmesi için bir yöntem temin etmektedir. Düzenleme ve ifade Eşli ölçümleri de bilimsel titizlik ve bulguların etkisini artırmak.
BSAS protokolü içinde kritik adımlar astar tasarım, amplikon optimizasyonu, ve kütüphane nesil / includeQC. Primerler uygun şekilde tasarlanmış ve farklı verimlilik 8'de yükseltmek değilse PCR önyargı tanıtıldı. Bu tür enzimatik olarak% 100 ve% 0 sitosin metile standart olarak metilasyon standartlarının kullanımı, eğer varsa metilasyon niceleme önyargı, derecesini belirlemek için kullanılır ve metilasyon 16 hesaplarken uygun bir yöntem olup, kontrol edilebilir. Tek bir yüksek-kaliteli amplikonu üretmek için PCR reaksiyonları optimize Benzer şekilde, dikkatli olunmalıdır. Herhangi bir amplikon protokolü detaylı önerilen edilen kılavuzları kullanarak, mevcut ise, optimizasyon adımları artan PCR devir sayıları ya da bsDNA giriş miktarını içerir. Astar-dimer dahil olmak üzere birden PCR ürünleri, varsa, optimizasyon adımları, bsDNA giriş miktarını azaltarak PCR primer molar giriş konsantrasyonları azalan, tavlama sıcaklıkları artan ya da PCR döngüsü sayısının azaltılması sayılabilir. Bu optimizasyon prosedürleri biri ya da bir kombinasyonu tek bir HIG oluşturmak için yeterli sonucu verirh-kalite amplikonu. Alternatif olarak, astar yeniden tasarlama tek amplikon veren yok primer setleri için iyi bir yaklaşımdır. Yeniden tasarımı uygun veya mümkün değildir, bu bölgeler için, hem ters primerler CpG siteleri CpG ileri primerler sitelerde ve adenin en ve guanin en az sitozin ve timin en en çalışabilir olmak üzere primer setleri dejenere. Ancak, bu primer setleri önyargı oluştuğunu hiçbir PCR bu protokol kapsamı dışında bir işlem sağlamak için daha fazla optimizasyon gerekiyor. Kalite kütüphaneleri başarı için son derece önemlidir. QC tedbirler sıralama önce kütüphanelerin boyutu, kalitesi ve miktarını belirlemek için yapılır emin olun. Dizileme reaksiyonları, düşük kaliteli kütüphanelerinin girişi ile başarısızlığa eğilimlidir. Metilasyon kantitatif olarak Önyargı metilasyon frekansları hem ileri hem de mevcut ve sıralama okur ters olması sağlanarak azaltılabilir. Ayrıca, CpG sitelerine hizalama üsleri kalite puanları yüksek işbirliği için ≥Q30 olmalıdırölçümde nfidence. Diğerleri, yukarıda açıklanan ölçümleri sağlanması, bisülfit dönüştürülmüş DNA 19 tagmentation reaksiyonlarında hiçbir önyargı önceden az göstermiş olsa da, düşük önyargı metilasyon kantitatif onay verir.
BSAS anda, ancak bu yöntemin, gelecekteki açılımı bu bisülfit dönüşümü 24 önce potasyum perrutenat sokulması 5-MC ve 5-HMC ayırt deneysel adımlar ayrıca CpG 5-HMC eşleştirilmiş ölçümleri sağlayacak, CpG bölgelerinin metilasyon ile ölçer. Bu DNA metilasyonu gen ifadesi düzenleyici rolleri belirlemek amacıyla, eşleştirilmiş metilasyon için izin vererek 5-MC ve 5-HMC ve anlatım verilerini hem BSAS programı etkisini artıracaktır. PCR amplikonlarının Transposome aracılı kütüphane hazırlanması büyütülmüş bölgelerden uçlarında azalma dizileme derinliği neden yoktur. Bu nedenle, yüksek ölçüde ilgi çekici bölgelerinde amplikonların ortasında bulunması için dizayn edilmelidir. NasılBSAS üretir, çünkü şimdiye kadar, sıralama> 1,000 X, güçlendirilmiş bölgelerin uçları yakın ölçümler yüksek kalır 5-Mc kantitatif doğruluk derinliklerinde okudum.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Colleen Van Kirk for mouse retina and cerebellum samples, and Peter Gregory for figure generation. The authors also thank Dr. Allison Gillaspy and the Laboratory for Molecular Biology and Cytometry Research core for access to the MiSeq. This work was supported by NIH grants DA029405, EY021716, and AG026607 and the Donald W. Reynolds Foundation.
Name | Company | Cat # | Comments |
Agilent 2100 Bioanlyzer | Agilent | G29393AA | |
Agilent RNA 6000 Nano kit | Agilent | 5067-1511 | |
Agilent High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Typhoon 9200 | Amersham/GE Healthcare Life Sciences | ||
Agencourt AMPure XP – PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
PowerPac Basic Power Supply | Bio Rad | 164-5050 | |
twin.tech PCR plate 96 | Eppendorf | 951020362 | semi-skirted |
Heatsealing Film | Eppendorf | 0030127838 | |
Heatsealing Foil | Eppendorf | 0030127854 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390000.024 | |
0.1-10ul Tips | Eppendorf | 0030073.002 | |
2-200ul Tips | Eppendorf | 0030073.045 | |
50-1000ul Tips | Eppendorf | 0030073.100 | |
MixMate | Eppendorf | 5353000.014 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 0030121.023 | |
Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424000.010 | |
2.0 mL Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 022363352 | |
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | 24 rxn |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | 24 indexes |
MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2002 | 300cycle |
KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4824 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | |
Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit | Life Technologies | R11490 | |
ProFlex 96-well PCR system | Life Technologies | 4484075 | |
Novex 6% TBE DNA gel | Life Technologies | EC6261BOX | 10-well |
Novex TBE Running Buffer | Life Technologies | LC6675 | 5X (1 L) |
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Life Technologies | LC6678 | 5X (10 mL) |
1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787-018 | |
Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | |
UltraPure 10mg/mL Ethidium Bromide | Life Technologies | 15585-011 | |
7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 | 384well block |
DynaMag-96 Side Skirted | Life Technologies | 12027 | |
SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices/VWR | 89429-532 | |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
Stainless Steel Beads | Qiagen | 69989 | 5 mm |
CLC Genomics Workbench | Qiagen | Software for methylation pipeline | |
QIAQuick PCR Purification kit | Qiagen | 28104 | 50 rxn |
TissueLyser II | Retsch/Qiagen | 85300 | |
Nuclease-Free Water | Sigma | W4502 | |
TRIS hydrochloride | Sigma | PHG0002-100G | |
Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
384-well Full-Skirted Plate, Standard | Thermo Scientific | AB-1384 | |
Absolute qPCR Seal | Thermo Scientific | AB-1170 | |
EZ DNA Methylation-Lightning kit | Zymo Research | D5030 | 50 rxn |
ZymoTaq DNA Polymerase | Zymo Research | E2001 | 50 rxn |