Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.
The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.
それは自然にシトシンメチル化1の形態のDNAの変更を発生するの最初の報告以来、半世紀以上となっている。シトシンのメチル化は、ベースリング上の5 番目の炭素にメチル基(5-mCと)は、最も頻繁に、哺乳動物ゲノム中のCpGジヌクレオチドモチーフで生じる有する修飾シトシンヌクレオチド塩基である。不在は、転写活性2に関連している遺伝子のプロモーター中の5-mCとの機能的な存在は、一般に、転写抑制と関連している。
驚異的な進歩が開発3、エピジェネティックなプロファイル4、癌の病因5,6、および他の研究領域の数のtransgeneration伝搬におけるDNAメチル化の役割についての我々の理解がなされている。新しい方法論は、DNAメチル化7をプロファイリングするために開発されているようにこれらの進歩の多くは、過去数年間で来ている。出現でと次世代シーケンシング(NGS)技術の普及は現在、全ゲノムまたはゲノム8の大きな領域全体にDNAメチル化をプロファイリングするための方法がいくつかあります。これらのアプローチは、DNAメチル化パターン及びDNAメチル化の差異を定量発見研究の可能性を開く。これらの仮説生成のアプローチに加えて、標的/仮説テストのDNAメチル化の定量法のための重要な必要性がある。
パイロシーケンシング、メチル化特異的PCR、および重亜硫酸変換したDNAの直接のサンガー配列決定は、対象地域を分析するための最も使用される方法であった( すなわち 、単一遺伝子のプロモーター領域またはCpGアイランド)9-12。メチル化シトシンのはそのまま13,14ままこれらの方法の全ては、亜硫酸水素塩変換、非メチル化シトシンのウラシルのに変換され、化学的脱アミノ化反応に依存している。 bisulfite-のPCR増幅差動メチル化塩基の違いとして読み出すことを可能チミン15とウラシルの交換で変換されたDNAをもたらす。非常に有用であるが、これらの方法には限界が低い定量的精度、短い読み取り長、および低いサンプルスループットを含む。これらの制限に対処するために我々は(BSAS)16重亜硫酸リコンシーケンシングと呼ばれるている方法を開発した。この方法の目的は、高い定量性を有する多数のサンプル中の目的の標的ゲノム領域を分析することができることである。
BSASは、既存の方法(重亜硫酸塩変換および領域特異的PCR増幅)の要素を使用して、単純な次世代ライブラリー構築とそれらを組み合わせた(トランスポ媒介)17及びベンチNGS 18( 図1)。このアプローチは、目的の任意の領域におけるシトシンのメチル化を調べるためのより定量的な、高スループット方法を提供する。ここでは、提示詳細方法とトラブルシューティングと品質はBSASプロセスをチェックするためのアプローチを説明します。
BSASサンプルとターゲットの数の両方数の高スループット能力を有する焦点、正確なDNAメチル化の定量を可能にする。さらに、トランスポ媒介tagmentationを使用して、このライブラリー生成は、より少ないインプットDNAを必要とし、より迅速で、伝統的なせん断およびその後のアダプターライゲーション技術より少ないステップが含まれています。既存の方法に比べてこれらの改善は、任意の目的の標的の正確な基本レベルのDNAメチル化解析を可能にする。また、BSASは全ゲノムバイサルファイト22またはキャプチャ23アプローチを用いて同定されている関心領域(差別的メチル化領域(DMRに)、CpGアイランド、調節領域)の確認のための新しい方法を提供する。直交確認のアプローチや、より定量的に正確な方法を使用すると、エピゲノム研究の分析的厳密さを向上させます。 BSASで達成高い読み取り深度再狭い信頼区間で正確な定量を可能にする正確な定量16にまで一貫した。さらに、単一の実験で多数のサンプルを分析する能力は、統計的検出力を増加させる全ゲノム法の確認のためのサンプルサイズを増加させることができる。現在の多くのエピジェネティック研究の弱さ。重要なことは、BSASはエピジェネティックな研究のための検証可能な仮説の生成を可能にする塩基特異的CpGメチル化の定量を、提供します。特定の応答エレメントでのそのような増加したメチル化のような仮説は、特定の転写因子の結合の減少をもたらすであろう。対のmRNA発現データと結合BSASは、組織または細胞集団の単一片内のエピジェネティックな調節およびmRNA発現の両方を得るための方法を提供する。規制と表現の対の測定値も、調査結果の科学的な厳格さとインパクトを高める。
BSASプロトコル内の重要なステップは、/プライマー設計、アンプリコンの最適化、およびライブラリ生成、QC。プライマーは、適切に設計され、異なる効率8で増幅されていない場合、PCRバイアスが導入される。そのような酵素的に生成された100%および0%のシトシンのメチル化の標準としてメチル化規格の使用は、もしあれば、メチル化定量バイアスの、程度を決定するために使用され、メチル化16を定量化する際に、適切な方法論的な制御であることができる。単一の高品質なアンプリコンを生成するためのPCR反応を最適化する場合も同様に、注意が払われるべきである。何リコンプロトコルで詳述示唆ガイドラインを使用して存在しない場合、最適化ステップが増加PCRサイクル数またはbsDNA入力量を含む。プライマー·ダイマーを含む複数のPCR産物は、存在する場合、最適化ステップは、bsDNA投入量を減少させるPCRプライマーのモル入力濃度を減少させ、アニール温度を増加させる、またはPCRのサイクル数を減少させることが含まれる。これらの最適化の手順のいずれかまたは組み合わせは、単一のHIGを生成するために、十分な結果が得られ時間品質のアンプリコン。また、プライマーを再設計することは、単一のアンプリコンを生じないプライマーセットのための良いアプローチです。再設計が適切なまたは不可能であるこれらの領域については、シトシンのチミンのフォワードプライマーおよびアデニンの中のCpG部位でのグアニンのリバースプライマー中のCpG部位での両方を含む縮重プライマーセットが動作する可能性があります。しかし、これらのプライマーセットは、PCRバイアスは、このプロトコルの範囲外のプロセスを生じていないことを確認するためにさらなる最適化を必要としています。品質ライブラリは、成功のために極めて重要である。 QC対策がシークエンシングの前にライブラリの大きさ、質と量を決定するために行われていることを確認します。配列決定反応は、低品質のライブラリーの入力に失敗しがちである。メチル化の定量におけるバイアスがメチル化頻度が前方の両方に存在し、シークエンシング読み取り逆にすることによって軽減することができる。さらに、CpG部位に合わせて拠点の品質スコアが高いCOのために≥Q30であるべき定量でnfidence。他のものは、上記の測定基準を確保し、重亜硫酸変換したDNA 19のtagmentation反応におけるバイアスなしに、以前にはほとんど示されているが、低バイアスメチル化定量を確認することができます。
BSASは現在、しかし、この方法の将来の拡張は、亜硫酸水素塩変換24の前にカリウム過ルテニウムを導入するなどの5-MCと5-HMCを区別する実験工程を追加してのCpG 5-HMCの対の測定値を可能にし、CpG部位でのメチル化を測定します。これは、DNAメチル化の遺伝子発現調節の役割を決定するために、対のメチル化を可能にすることにより、5-mCと5-HMC、および発現データの両方をBSASユーティリティの影響を増加させる。 PCRアンプリコンのトランスポ媒介ライブラリ調製物は増幅された領域の端部で低下し、配列決定深度をもたらすない。したがって、高い関心領域は、アンプリコンの中央に存在するように設計されるべきである。どうやってBSASが生成するので、今までに、シークエンシング>は千X、増幅された領域の端部付近の測定は高いまま5-MCの定量的な精度の深さを読み取る。
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Colleen Van Kirk for mouse retina and cerebellum samples, and Peter Gregory for figure generation. The authors also thank Dr. Allison Gillaspy and the Laboratory for Molecular Biology and Cytometry Research core for access to the MiSeq. This work was supported by NIH grants DA029405, EY021716, and AG026607 and the Donald W. Reynolds Foundation.
Name | Company | Cat # | Comments |
Agilent 2100 Bioanlyzer | Agilent | G29393AA | |
Agilent RNA 6000 Nano kit | Agilent | 5067-1511 | |
Agilent High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Typhoon 9200 | Amersham/GE Healthcare Life Sciences | ||
Agencourt AMPure XP – PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
PowerPac Basic Power Supply | Bio Rad | 164-5050 | |
twin.tech PCR plate 96 | Eppendorf | 951020362 | semi-skirted |
Heatsealing Film | Eppendorf | 0030127838 | |
Heatsealing Foil | Eppendorf | 0030127854 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390000.024 | |
0.1-10ul Tips | Eppendorf | 0030073.002 | |
2-200ul Tips | Eppendorf | 0030073.045 | |
50-1000ul Tips | Eppendorf | 0030073.100 | |
MixMate | Eppendorf | 5353000.014 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 0030121.023 | |
Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424000.010 | |
2.0 mL Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 022363352 | |
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | 24 rxn |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | 24 indexes |
MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2002 | 300cycle |
KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4824 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | |
Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit | Life Technologies | R11490 | |
ProFlex 96-well PCR system | Life Technologies | 4484075 | |
Novex 6% TBE DNA gel | Life Technologies | EC6261BOX | 10-well |
Novex TBE Running Buffer | Life Technologies | LC6675 | 5X (1 L) |
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Life Technologies | LC6678 | 5X (10 mL) |
1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787-018 | |
Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | |
UltraPure 10mg/mL Ethidium Bromide | Life Technologies | 15585-011 | |
7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 | 384well block |
DynaMag-96 Side Skirted | Life Technologies | 12027 | |
SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices/VWR | 89429-532 | |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
Stainless Steel Beads | Qiagen | 69989 | 5 mm |
CLC Genomics Workbench | Qiagen | Software for methylation pipeline | |
QIAQuick PCR Purification kit | Qiagen | 28104 | 50 rxn |
TissueLyser II | Retsch/Qiagen | 85300 | |
Nuclease-Free Water | Sigma | W4502 | |
TRIS hydrochloride | Sigma | PHG0002-100G | |
Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
384-well Full-Skirted Plate, Standard | Thermo Scientific | AB-1384 | |
Absolute qPCR Seal | Thermo Scientific | AB-1170 | |
EZ DNA Methylation-Lightning kit | Zymo Research | D5030 | 50 rxn |
ZymoTaq DNA Polymerase | Zymo Research | E2001 | 50 rxn |