Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.
The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.
Het is meer dan een halve eeuw geleden dat het eerste verslag van natuurlijk voorkomende DNA-veranderingen in de vorm van cytosine methylatie 1. Cytosine methylatie is een gemodificeerd cytosine nucleotide aan waarin de 5e koolstofatoom op de basisring een methylgroep (5-mC), meest voorkomende in het CpG dinucleotide motief in zoogdieren genomen. De functionele aanwezigheid van 5-mC in genpromoters wordt algemeen geassocieerd met transcriptionele repressie, terwijl de afwezigheid is geassocieerd met transcriptionele activiteit 2.
Enorme vooruitgang geboekt in ons begrip van de rol van DNA-methylatie in ontwikkeling 3, transgeneration voortplanting van epigenetische profielen 4, kanker pathogenese 5,6, en een aantal andere onderzoeksgebieden. Veel van deze vooruitgang zijn in de laatste jaren nieuwe methoden ontwikkeld om DNA methylatie 7 profileren. Met de komst enpopularisering van next-generation sequencing (NGS) technieken zijn er nu een aantal methoden om DNA-methylatie profileren in een hele genoom of grote gebieden van een genoom 8. Deze benaderingen de mogelijkheid open studies ontdekking dat DNA methylatie patronen en verschillen in DNA methylering kwantificeren. Naast deze hypothese genererende aanpak is er grote behoefte aan gerichte / hypothese testen DNA methylatie kwantificatie werkwijzen.
Pyrosequencing, methylatie specifieke PCR, en directe Sanger sequencing van bisulfiet geconverteerde DNA zijn de meest gebruikte methoden voor de analyse van gerichte regio's geweest (dat wil zeggen, een promotor regio van een enkel gen of een CpG eiland) 9-12. Al deze werkwijzen afhankelijk bisulfiet conversie, een chemische deamineringsreactie waarbij gemethyleerde cytosine worden omgezet in uracil, terwijl gemethyleerde cytosine blijven intact 13,14. PCR amplificatie van bisulfite-geconverteerde DNA resultaten in vervanging van uracil met thymine 15 waardoor het differentieel methylering uit te lezen als een basis verschil. Hoewel zeer nuttig, de beperkingen van deze methoden zijn lage kwantitatieve nauwkeurigheid, korte lees- lengte, en de lage monster doorzet. Om deze beperkingen te pakken we ontwikkelden een methode die we hebben Bisulfiet Amplicon Sequencing (BSAS) 16 genoemd. Het doel van deze methode is in staat om de beoogde genomische gebieden van belang te analyseren in een groot aantal monsters met een hoge kwantitatieve nauwkeurigheid.
BSAS gebruikt elementen van bestaande methoden (bisulfiet conversie en regiospecifieke PCR amplificatie) en combineert deze met eenvoudige volgende generatie bibliotheek constructie (transposome-gemedieerde) 17 en Benchtop NGS 18 (figuur 1). Deze benadering voorziet in een kwantitatieve en een hogere throughput methode om de cytosine methylatie in elk gebied van belang. Hier presenteren wemethode in detail beschrijven aanpak voor het oplossen van problemen en de kwaliteit controleren van de BSAS proces.
BSAS zorgt voor gerichte, nauwkeurige DNA-methylatie kwantificatie met hoge doorvoer mogelijkheden in zowel het aantal monsters en het aantal doelen. Daarnaast is deze bibliotheek generatie behulp-transposome gemedieerde tagmentation vereist minder ingang DNA, is sneller en bevat minder stappen dan de traditionele scheren en de daaropvolgende adapter ligatietechnieken. Deze verbeteringen ten opzichte van bestaande methoden maken het precies base-level DNA methylatie analyse van enige doelwit van belang. Bovendien BSAS biedt een nieuwe methode voor de bevestiging van de regio's van belang (differentieel methylatie regio's (DMR's), CpG eilanden, regulerende regio's) die zijn geïdentificeerd door middel van genoomwijde bisulfite 22 of vastleggen 23 benaderingen. Met behulp van orthogonale bevestiging benaderingen en meer kwantitatief nauwkeuriger methoden verbetert de analytische strengheid van epigenomisch studies. De hoge lees diepte bereikt met BSAS accurate kwantificering in een smal interval rejectsconsulting in nauwkeurige kwantificatie 16. Bovendien kan de mogelijkheid om veel monsters uitgevoerd in een enkel experiment de monstergrootte voor bevestigingen van volledige genoom methoden, waarvan de statistische kracht zal toenemen toenemen; Een zwakte van veel van de huidige epigenetische studies. Belangrijk BSAS biedt basespecifieke CpG methylering kwantificering, waardoor het genereren van testbare hypothesen epigenetisch onderzoek. Hypotheses zoals verhoogde methylatie in een specifiek responselement leidt tot verminderde binding van een specifieke transcriptiefactor. BSAS combinatie met gepaarde mRNA expressie data, een werkwijze voor het verkrijgen van zowel epigenetische regulatie en mRNA expressie in een stuk weefsel of celpopulatie. Gepaarde metingen van regulering en expressie verhogen ook de wetenschappelijke nauwkeurigheid en de impact van de bevindingen.
Kritische stappen binnen de BSAS protocol omvatten primer ontwerp, amplicon optimalisatie en bibliotheek generatie /QC. PCR voorspanning wordt geïntroduceerd als primers niet goed zijn ontworpen en versterken op verschillende efficiëntie 8. Het gebruik van methylering standaarden, zoals enzymatisch gegenereerde 100% en 0% cytosine gemethyleerd normen kan worden gebruikt om de mate te bepalen, indien aanwezig, van methylatie kwantificering bias, en is een goede methodologische controle kwantificering methylatie 16. Ook moet erop worden gelet bij het optimaliseren van PCR-reacties voor het genereren van een enkele hoogwaardige amplicon. Als er geen amplicon aanwezig is met behulp van de voorgestelde richtlijnen beschreven in het protocol, optimalisatie stappen omvatten het verhogen van de PCR-cyclus nummers of bsDNA ingang hoeveelheid. Als er meerdere PCR producten, waaronder primer dimeren, optimalisatiestappen omvatten afnemende bsDNA ingang bedrag verlagen van de PCR-primer molaire ingangsconcentraties verhogen annealing temperaturen verminderen of PCR- cyclusnummer. Eén of een combinatie van deze optimalisatie procedures levert voldoende resultaten één hig genererenh kwaliteit amplicon. Als alternatief herinrichten primers is een goede aanpak voor primer sets die geen enkele amplicon hoeft opleveren. Voor de regio's waar herontwerp is niet geschikt of mogelijk is, ontaarden primersets waaronder zowel cytosine en thymine bij CpG sites in voorwaartse primers en adenine en guanine bij CpG sites in omgekeerde primers kunnen werken. Echter, deze primer sets moeten verdere optimalisatie geen PCR voorspanning optreedt, een werkwijze buiten het toepassingsgebied van dit protocol. Kwaliteit bibliotheken zijn uitermate belangrijk voor succes. Zorg ervoor dat QC maatregelen worden uitgevoerd om te bepalen omvang, kwaliteit en kwantiteit van bibliotheken voor sequencing. Sequentiëringsreacties zijn gevoelig voor storing met ingang van lage kwaliteit bibliotheken. Bias in methylering kwantificatie kan worden beperkt door ervoor te zorgen dat methylatie frequenties aanwezig zijn in zowel vooruit als achteruit sequencing leest. Bovendien moet de kwaliteit scores van basen uitlijnen om CpG sites ≥Q30 voor hoge confidence in kwantificatie. Terwijl anderen hebben aangetoond voorheen weinig tot geen bias in tagmentation reacties van bisulfiet geconverteerde DNA-19, het waarborgen van de hierboven beschreven metrics zorgt voor bevestiging van laag vooringenomenheid methylatie kwantificatie.
BSAS Momenteel meet methylatie op CpG zal echter toekomstige uitbreidingen van deze methode gepaarde metingen van CpG 5-HMC mogelijk met de toevoeging van experimentele stappen onderscheiden 5-mC en 5-HMC zoals invoering kalium perruthenaat voor bisulfiet conversie 24. Dit zal het effect van BSAS nut om genexpressie regulerende rol van DNA methylering bepalen verhogen doordat voor gepaarde methylatie, zowel 5-mC en 5-HMC en expressie data. Transposome gemedieerde bibliotheek bereiding van PCR amplicons resulteert in verminderde sequencing diepte de uiteinden van geamplificeerde gebieden. Daarom moet gebieden van groot belang zijn ontworpen in het midden van amplicons te verblijven. Hoeooit, omdat BSAS genereert sequencing lees diepte> 1000 X, de kwantitatieve nauwkeurigheid van 5-mC metingen nabij de einden van geamplificeerde regio blijft hoog.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Colleen Van Kirk for mouse retina and cerebellum samples, and Peter Gregory for figure generation. The authors also thank Dr. Allison Gillaspy and the Laboratory for Molecular Biology and Cytometry Research core for access to the MiSeq. This work was supported by NIH grants DA029405, EY021716, and AG026607 and the Donald W. Reynolds Foundation.
Name | Company | Cat # | Comments |
Agilent 2100 Bioanlyzer | Agilent | G29393AA | |
Agilent RNA 6000 Nano kit | Agilent | 5067-1511 | |
Agilent High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Typhoon 9200 | Amersham/GE Healthcare Life Sciences | ||
Agencourt AMPure XP – PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
PowerPac Basic Power Supply | Bio Rad | 164-5050 | |
twin.tech PCR plate 96 | Eppendorf | 951020362 | semi-skirted |
Heatsealing Film | Eppendorf | 0030127838 | |
Heatsealing Foil | Eppendorf | 0030127854 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390000.024 | |
0.1-10ul Tips | Eppendorf | 0030073.002 | |
2-200ul Tips | Eppendorf | 0030073.045 | |
50-1000ul Tips | Eppendorf | 0030073.100 | |
MixMate | Eppendorf | 5353000.014 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 0030121.023 | |
Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424000.010 | |
2.0 mL Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 022363352 | |
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | 24 rxn |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | 24 indexes |
MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2002 | 300cycle |
KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4824 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | |
Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit | Life Technologies | R11490 | |
ProFlex 96-well PCR system | Life Technologies | 4484075 | |
Novex 6% TBE DNA gel | Life Technologies | EC6261BOX | 10-well |
Novex TBE Running Buffer | Life Technologies | LC6675 | 5X (1 L) |
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Life Technologies | LC6678 | 5X (10 mL) |
1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787-018 | |
Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | |
UltraPure 10mg/mL Ethidium Bromide | Life Technologies | 15585-011 | |
7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 | 384well block |
DynaMag-96 Side Skirted | Life Technologies | 12027 | |
SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices/VWR | 89429-532 | |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
Stainless Steel Beads | Qiagen | 69989 | 5 mm |
CLC Genomics Workbench | Qiagen | Software for methylation pipeline | |
QIAQuick PCR Purification kit | Qiagen | 28104 | 50 rxn |
TissueLyser II | Retsch/Qiagen | 85300 | |
Nuclease-Free Water | Sigma | W4502 | |
TRIS hydrochloride | Sigma | PHG0002-100G | |
Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
384-well Full-Skirted Plate, Standard | Thermo Scientific | AB-1384 | |
Absolute qPCR Seal | Thermo Scientific | AB-1170 | |
EZ DNA Methylation-Lightning kit | Zymo Research | D5030 | 50 rxn |
ZymoTaq DNA Polymerase | Zymo Research | E2001 | 50 rxn |