Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.
The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.
그것은 자연스럽게 시토신 메틸화 (1)의 형태로 DNA의 변형 발생의 첫 번째 보고서 이후 반세기에 걸쳐있다. 시토신 메틸화베이스 링에 5 번째 탄소 메틸기 (5-MC)는, 가장 빈번하게 포유 동물 게놈에서의 CpG 디 뉴클레오티드 모티브에서 발생 갖는 변성 시토신 뉴클레오티드 염기이다. 부재가 전사 활성과 연관이있는 동안 유전자 프로모터의 5-MC의 존재는 일반적으로 작용 성, 전사 억제와 관련된다.
엄청난 진보 발전 3의 DNA 메틸화, 후생 유전 학적 프로파일 4, 5,6 암 발병 기전 및 다른 연구 분야의 수의 transgeneration 전파의 역할에 대한 이해 만들어왔다. 신규 방법론은 DNA 메틸화 7 프로파일 개발되었다 이러한 많은 진보는 지난 몇 년 동안왔다. 출현 및차세대 시퀀싱 (NGS) 기술의 대중화는 이제 전체 게놈 또는 게놈 (8)의 큰 영역에 걸쳐 DNA 메틸화를 프로파일 링하는 방법은 여러 가지가있을 수 있습니다. 이러한 접근은 DNA 메틸화 패턴 및 DNA 메틸화의 차이를 정량화 연구의 발견 가능성을 연다. 이러한 가설 발생 방법에 더하여, 타겟 / 가설 테스트 DNA 메틸화 정량 방법에 대한 상당한 필요성이 존재한다.
pyrosequencing 기법, 메틸화 특이 PCR, 바이 설 파이트 변환 된 DNA와 직접 생거 시퀀싱은 대상 영역의 분석을 위해 가장 많이 사용되는 방법이 있었다 (예를 들어, 하나의 유전자의 프로모터 영역 또는 CpG 아일랜드) 9-12. 메틸화 된 시토신의 그대로 13, 14을 유지하면서 이러한 모든 방법, 중아 변환, 메틸화 된 시토신의이 우라실의로 변환 화학 탈 아미 노화 반응에 의존하고있다. bisulfite-의 PCR 증폭차동 메틸화 염기 차이로서 판독 할 수 티민 15 우라실의 여분의 DNA에 변환 결과. 매우 유용하지만, 이러한 방법에 제한이 낮은 양적 정확성, 짧은 읽기 길이, 낮은 시료 처리를 포함한다. 이러한 한계를 해결하기 위해 우리는 우리가 (BSAS) 16 바이 설 파이트의 증폭 시퀀싱이라고 한 방법을 개발했다. 이 방법의 목적은 높은 정밀도로 정량 많은 수의 샘플에 대한 관심의 대상 게놈 영역을 분석 할 수 있어야한다.
BSAS은 기존의 방법의 요소 (중아 변환 및 지역별 PCR 증폭)를 사용하고 간단한 차세대 라이브러리 건설 (transposome 매개) (17) 및 벤치 탑 NGS (18) (그림 1)로 결합되어 있습니다. 이 방법은 관심의 영역에서 시토신 메틸화를 검사 할 수있는 정량적 및 높은 처리량 방법을 제공한다. 여기에 우리가 제시세부 방법 및 문제 해결과 품질이 BSAS 프로세스를 확인하는 방법을 설명합니다.
BSAS 샘플 및 대상의 수 두 수의 높은 처리량 기능에 초점을 맞춘, 정확한 DNA 메틸화 정량 수 있습니다. 또한, transposome 매개 tagmentation을 사용하여이 라이브러리 세대는 빠르고, 적은 입력 DNA입니다 필요로하며, 기존의 전단 및 후속 어댑터 결찰 기술보다 더 적은 단계가 포함되어 있습니다. 기존의 방법에 비해 이러한 개선은 관심의 대상의 정확한 기본 수준 DNA 메틸화 분석 할 수 있습니다. 또한, BSAS는 전체 게놈 중아 (22) 또는 캡처 (23) 접근 방식을 사용하여 식별 된 관심의 영역 (차별적 메틸화 지역 (DMRS)의 CpG 섬, 규제 지역)의 확인을위한 새로운 방법을 제공한다. 직교 확인 방법 등을 정량적으로 정확한 방법을 사용하여 에피 지노믹스 연구의 치밀한 분석을 향상시킨다. BSAS 달성 높은 읽기 깊이는 다시 좁은 신뢰 구간의 정확한 정량이 가능정확한 정량 16 sulting. 또한, 하나의 실험에서 많은 샘플을 실행할 수있는 능력은 통계적 전력을 증가 전체 게놈의 확정 방법에 대한 샘플 크기를 증가시킬 수있다; 많은 현재의 후생 유전 학적 연구의 약점. 중요한 것은, BSAS은 후생 유전 학적 연구에 대한 검증 가능한 가설의 생성을 허용베이스 고유의 CpG 메틸화 정량을 제공합니다. 이러한 특정 응답 요소의 증가 메틸화와 같은 가설이 감소 특정 전사 인자의 결합을 발생합니다. 한 쌍의 mRNA 발현 데이터와 결합 BSAS은 조직 또는 세포 집단의 단일 조각 내에 후생 유전 학적 규제 mRNA 발현 양을 얻기위한 방법을 제공한다. 규제와 표현의 짝 측정은 또한 과학적인 엄격함과 결과의 영향을 증가시킨다.
BSAS 프로토콜 내에서 중요한 단계는 프라이머 디자인, 앰플 리콘 최적화 및 라이브러리 생성 / 포함QC. 프라이머가 적절하게 설계 효율이 다른 8로 증폭하지 않으면 PCR 바이어스가 도입된다. 이러한 효소 적으로 생성 된 100 % 및 0 % 시토신 메틸화 표준 같은 메틸화 표준의 사용은 어떤 경우 메틸화 정량 바이어스, 정도를 결정하는데 사용하고, 메틸화 (16)을 정량 할 때 적절한 방법론 제어하다 할 수있다. 단일 고품질의 증폭 물을 생성하기위한 PCR 반응을 최적화 할 때 마찬가지로주의를 기울여야한다. 앰플 리콘은 어떠한 프로토콜에서 상세히 제시된 지침을 이용하여 존재하지 않는 경우, 최적화 단계가 증가하는 PCR 사이클 번호 또는 bsDNA 입력량을 포함한다. 프라이머 이량 체 등 다양한 PCR 제품들이 존재하는 경우, 최적화 단계는, bsDNA 입력량 감소 PCR 프라이머 몰 입력 농도 저하, 소둔 온도의 증가, 또는 PCR 싸이클 횟수 감소 등. 이러한 최적화 절차 중 하나 또는 조합이 단일 HIG를 생성하기에 충분한 결과를 얻을H-품질 증폭 물. 또한, 프라이머를 재 설계하는 것은 하나의 증폭을 생성하지 않는 프라이머 세트를위한 좋은 방법입니다. 재 설계에 적합 또는 수 없습니다 그 지역의 경우 두 역 프라이머에서의 CpG 사이트에서의 CpG 앞으로 프라이머의 사이트와 아데닌의 구아닌의에서 시토신의 티민의이 작동을 포함 프라이머 세트를 퇴화. 그러나, 이들 프라이머 세트는 바이어스가 발생하는 어떠한 PCR,이 프로토콜의 범위를 벗어난 프로세스 없도록 위해 추가 최적화를 필요로한다. 품질 라이브러리는 성공을 위해 매우 중요합니다. 품질 관리 조치를 시퀀싱하기 전에 라이브러리의 크기, 질과 양을 결정하기 위해 수행되어 있는지 확인합니다. 시퀀싱 반응은 저품질 라이브러리의 입력에 실패하는 경향이있다. 메틸화 정량의 바이어스는 메틸화 주파수가 앞으로 모두에 존재하고 시퀀싱 읽기 역하도록함으로써 완화 될 수있다. 또한,의 CpG 사이트에 정렬 기지의 품질 평가 점수가 높은 협력을위한 ≥Q30해야정량에 nfidence. 다른 사람은 위에 설명 된 기준을 보장 중아 변환 된 DNA (19)의 tagmentation 반응에서 어떤 편견 이전에 작은 표시하고 있지만 낮은 바이어스 메틸화 정량의 확인을 할 수 있습니다.
BSAS 현재 그러나,이 방법의 미래 확장은 바이 설 파이트 변환 24 전에 칼륨 퍼 루테 네이트를 도입으로하는 5- MC 및 5- HMC 구별 실험 단계에 첨가 된 CpG -5- HMC의 페어링 측정을 허용 소비재 부위에서 메틸화를 측정한다. 이것은 DNA 메틸화 유전자 발현 조절의 역할을 결정하기 위해, 한 쌍의 메틸화시킴으로써 5-MC 및 5- HMC 및 발현 데이터를 모두 BSAS 유틸리티의 영향을 증가시킬 것이다. PCR 증폭 산물의 Transposome 매개 라이브러리 제조 증폭 영역의 단부에서 감소 된 깊이 순서화 될 않는다. 따라서, 높은 관심의 영역이 증폭 산물의 중간에 위치하도록 설계되어야한다. 방법BSAS가 생성하기 때문에 지금까지, 시퀀싱> 1000 X, 증폭 된 영역의 끝 근처 측정이 여전히 높은 5-MC의 양적 정도의 깊이를 읽어보십시오.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Colleen Van Kirk for mouse retina and cerebellum samples, and Peter Gregory for figure generation. The authors also thank Dr. Allison Gillaspy and the Laboratory for Molecular Biology and Cytometry Research core for access to the MiSeq. This work was supported by NIH grants DA029405, EY021716, and AG026607 and the Donald W. Reynolds Foundation.
Name | Company | Cat # | Comments |
Agilent 2100 Bioanlyzer | Agilent | G29393AA | |
Agilent RNA 6000 Nano kit | Agilent | 5067-1511 | |
Agilent High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Typhoon 9200 | Amersham/GE Healthcare Life Sciences | ||
Agencourt AMPure XP – PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
PowerPac Basic Power Supply | Bio Rad | 164-5050 | |
twin.tech PCR plate 96 | Eppendorf | 951020362 | semi-skirted |
Heatsealing Film | Eppendorf | 0030127838 | |
Heatsealing Foil | Eppendorf | 0030127854 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390000.024 | |
0.1-10ul Tips | Eppendorf | 0030073.002 | |
2-200ul Tips | Eppendorf | 0030073.045 | |
50-1000ul Tips | Eppendorf | 0030073.100 | |
MixMate | Eppendorf | 5353000.014 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 0030121.023 | |
Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424000.010 | |
2.0 mL Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 022363352 | |
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | 24 rxn |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | 24 indexes |
MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2002 | 300cycle |
KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4824 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | |
Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit | Life Technologies | R11490 | |
ProFlex 96-well PCR system | Life Technologies | 4484075 | |
Novex 6% TBE DNA gel | Life Technologies | EC6261BOX | 10-well |
Novex TBE Running Buffer | Life Technologies | LC6675 | 5X (1 L) |
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Life Technologies | LC6678 | 5X (10 mL) |
1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787-018 | |
Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | |
UltraPure 10mg/mL Ethidium Bromide | Life Technologies | 15585-011 | |
7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 | 384well block |
DynaMag-96 Side Skirted | Life Technologies | 12027 | |
SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices/VWR | 89429-532 | |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
Stainless Steel Beads | Qiagen | 69989 | 5 mm |
CLC Genomics Workbench | Qiagen | Software for methylation pipeline | |
QIAQuick PCR Purification kit | Qiagen | 28104 | 50 rxn |
TissueLyser II | Retsch/Qiagen | 85300 | |
Nuclease-Free Water | Sigma | W4502 | |
TRIS hydrochloride | Sigma | PHG0002-100G | |
Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
384-well Full-Skirted Plate, Standard | Thermo Scientific | AB-1384 | |
Absolute qPCR Seal | Thermo Scientific | AB-1170 | |
EZ DNA Methylation-Lightning kit | Zymo Research | D5030 | 50 rxn |
ZymoTaq DNA Polymerase | Zymo Research | E2001 | 50 rxn |