Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.
The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.
自的天然存在的DNA的修饰中胞嘧啶甲基1的形式中,第一报告它已经过了半个世纪。胞嘧啶甲基化是其中基环上的5 个碳具有一个甲基(5-MC),最常在哺乳动物基因组中的CpG二核苷酸基序中产生的修饰的胞嘧啶核苷酸碱基。的5-MC在基因的启动子功能的存在通常与转录抑制有关,而没有与转录活性相关联。
巨大进展已在我们的DNA甲基化在发展3,后生轮廓4,癌症发病5,6,和其他一些研究领域transgeneration传播中的作用的理解。许多的这些进步已经走在过去的几年中作为新的方法已经被开发来分析DNA甲基化7。同的出现和下一代测序(NGS)技术的普及,现在有许多方法来跨越整个基因组或基因组8的大区域轮廓的DNA甲基化。这些方法打开发现研究,量化DNA甲基化模式和DNA甲基化的差异的可能性。除了这些假设产生的方法,有针对性/假设检验的DNA甲基化的定量方法显著需求。
焦磷酸测序,甲基化特异性PCR,和亚硫酸氢盐转化的DNA直接Sanger测序一直是最常用的方法为目标区域的分析( 即 ,单一的基因的启动子区域或CpG岛)9-12。所有这些方法都依赖于亚硫酸氢盐转化率,其中,非甲基化胞嘧啶的转化成尿嘧啶的化学脱氨反应,而甲基化胞嘧啶的保持完好13,14。的bisulfite- PCR扩增转换后的DNA结果更换尿嘧啶与胸腺嘧啶15允许差异甲基化读出的基差。而非常有用,所述限制于这些方法包括低定量准确,短的读取长度,以及低样品通量。为了解决这些限制我们开发我们称之为亚硫酸氢盐测序扩增子(BSAS)16的方法。该方法的目标是能够分析所关注目标的基因组区域中的大量的高定量准确的样品。
BSAS使用的现有方法的元素(亚硫酸氢盐转化率和区域特异性PCR扩增),并将其与简单下一代文库构建(座子介导的)17和台式NGS 18( 图1)。这种方法提供了一个更定量和更高的吞吐量的方法,研究在任何感兴趣的区域中的胞嘧啶甲基化。在这里,我们提出了方法进行详细描述,并进行故障排除和质量检查BSAS过程的方法。
BSAS允许集中,准确的DNA甲基化与定量两个样本数量和指标数量的高吞吐量的能力。此外,该库一代使用转座子介导的tagmentation需要较少的输入DNA,更快,包含了比传统的剪切和随后的适配器连接技术更少的步骤。这些改进在现有的方法允许任何感兴趣的目标进行精确基层DNA甲基化分析。此外,BSAS为确认已使用的全基因组亚硫酸氢钠22或23捕捉方法确定的感兴趣区域(差异甲基化区域(的DMR),CpG 岛,监管区)的新方法。采用正交确认的方法和更精确的定量方法,提高了表观基因研究的严格分析。实现了与BSAS高阅读深度允许在一个窄的置信区间准确定量,再质保的义务在精确的定量分析16。此外,为了在单次实验运行许多样品的能力可以增加对整个基因组的方法确认,这将增加功率统计样本大小;目前许多后生研究的一个弱点。重要的是,BSAS提供一个碱基特异性CpG甲基化的定量,其允许可检验的假设为后生研究的产生。假设如在特定的反应元件增加甲基化将导致一个特定的转录因子降低的结合。 BSAS,结合配对mRNA表达数据,提供了用于在一个单一的一块组织或细胞群的获得两种表观遗传调节和表达的方法。调控和表达的配对测量,也增加了科学严谨和结果的影响。
在BSAS协议中的关键步骤包括引物设计,扩增优化和生成库/QC。 PCR偏见介绍,如果引不正确的设计和放大,在不同的效率8。使用甲基化的标准,如酶促产生100%和0%的胞嘧啶甲基化的标准,可以用于确定程度,如果有的话,甲基化定量的偏差,并且是一个适当的方法控制量化甲基化16时。类似地,应注意优化PCR反应,用于产生单个高质量扩增子时服用。如果没有扩增子是本使用在协议详述所建议的准则,优化步骤包括增加的PCR循环数或bsDNA输入量。如果有多个PCR产物,包括引物二聚体,优化步骤包括减小bsDNA输入量,降低了PCR引物的摩尔浓度的输入,提高退火温度,或降低PCR循环数。这些优化过程的一个或一个组合产生足够的结果,以产生一个单一的集锦。H-质量的扩增子。另外,重新设计引物对引物不产生一个扩增子的好办法。对于这些地区的地方重新设计不适合或没有可能,退化引物包括胞嘧啶的和胸腺嘧啶的在正向引物CpG位点和腺嘌呤的和鸟嘌呤的在反向引CpG位点可能工作。然而,这些引物组还需要进一步优化,以确保无PCR的偏差发生,这个协议的范围之外的处理。质量库是成功的非常重要的。确保QC措施进行了测序前确定库的规模,质量和数量。测序反应是容易发生故障与低质量的库的输入。偏压中的甲基化的定量可以通过确保甲基化频率存在于正向和反向测序读数来缓解。此外,基地调整至CpG位点的质量分数应≥Q30高协nfidence的定量。虽然其他人已经表明以前很少在亚硫酸氢盐转化的DNA 19 tagmentation反应没有偏差,保证上述指标可以确认低偏置甲基化定量。
BSAS目前在CpG位点的甲基化测量,但是,这种方法的未来的扩展将允许的CpG 5- HMC的成对测量用加入了如引入钾高钌酸铵重亚硫酸盐转化24之前实验步骤5-MC和5- HMC区分。这将增加BSAS效用的影响通过允许配对甲基化,既5-MC和5- HMC,和表达数据,以确定DNA甲基化的基因表达的调节作用。转座子介导的文库制备的PCR扩增子并导致降低测序深度在扩增区域的端部。因此,高的兴趣的区域的设计应该驻留在扩增子的中间。怎么样以往,因为BSAS生成测序阅读深度> 1000的X,5-MC定量精度邻近扩增区域的端部测量仍然很高。
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Colleen Van Kirk for mouse retina and cerebellum samples, and Peter Gregory for figure generation. The authors also thank Dr. Allison Gillaspy and the Laboratory for Molecular Biology and Cytometry Research core for access to the MiSeq. This work was supported by NIH grants DA029405, EY021716, and AG026607 and the Donald W. Reynolds Foundation.
Name | Company | Cat # | Comments |
Agilent 2100 Bioanlyzer | Agilent | G29393AA | |
Agilent RNA 6000 Nano kit | Agilent | 5067-1511 | |
Agilent High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Typhoon 9200 | Amersham/GE Healthcare Life Sciences | ||
Agencourt AMPure XP – PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
PowerPac Basic Power Supply | Bio Rad | 164-5050 | |
twin.tech PCR plate 96 | Eppendorf | 951020362 | semi-skirted |
Heatsealing Film | Eppendorf | 0030127838 | |
Heatsealing Foil | Eppendorf | 0030127854 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390000.024 | |
0.1-10ul Tips | Eppendorf | 0030073.002 | |
2-200ul Tips | Eppendorf | 0030073.045 | |
50-1000ul Tips | Eppendorf | 0030073.100 | |
MixMate | Eppendorf | 5353000.014 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 0030121.023 | |
Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424000.010 | |
2.0 mL Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 022363352 | |
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | 24 rxn |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | 24 indexes |
MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2002 | 300cycle |
KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4824 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | |
Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit | Life Technologies | R11490 | |
ProFlex 96-well PCR system | Life Technologies | 4484075 | |
Novex 6% TBE DNA gel | Life Technologies | EC6261BOX | 10-well |
Novex TBE Running Buffer | Life Technologies | LC6675 | 5X (1 L) |
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Life Technologies | LC6678 | 5X (10 mL) |
1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787-018 | |
Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | |
UltraPure 10mg/mL Ethidium Bromide | Life Technologies | 15585-011 | |
7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 | 384well block |
DynaMag-96 Side Skirted | Life Technologies | 12027 | |
SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices/VWR | 89429-532 | |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
Stainless Steel Beads | Qiagen | 69989 | 5 mm |
CLC Genomics Workbench | Qiagen | Software for methylation pipeline | |
QIAQuick PCR Purification kit | Qiagen | 28104 | 50 rxn |
TissueLyser II | Retsch/Qiagen | 85300 | |
Nuclease-Free Water | Sigma | W4502 | |
TRIS hydrochloride | Sigma | PHG0002-100G | |
Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
384-well Full-Skirted Plate, Standard | Thermo Scientific | AB-1384 | |
Absolute qPCR Seal | Thermo Scientific | AB-1170 | |
EZ DNA Methylation-Lightning kit | Zymo Research | D5030 | 50 rxn |
ZymoTaq DNA Polymerase | Zymo Research | E2001 | 50 rxn |