Nos métodos padrão de cultura de células são retiradas do seu ambiente fisiológico e cultivadas na superfície de plástico de um prato. Para estudar o comportamento de células de medula óssea humana primária foi criado um sistema de cultura de 3-D, onde as células são cultivadas sob condições sintetizando o microambiente nativa do tecido.
A cultura de tecidos tem sido uma ferramenta valiosa para estudar vários aspectos da função celular, a partir de desenvolvimento normal para a doença. Os métodos de cultura de células convencionais contam com a capacidade das células, quer para fixar a um substrato sólido de um prato de cultura de tecido ou de crescer em suspensão num meio líquido. Várias linhas de células imortais foram criados e cresceram utilizando tais abordagens, no entanto, esses métodos falham freqüentemente quando pilhas precisam ser cultivadas ex vivo. Tal falha é atribuída à ausência de componentes de matriz extracelular apropriados do microambiente do tecido a partir de sistemas de cultura de tecido padrão em plástico é utilizado como uma superfície para o crescimento celular. A matriz extracelular é um componente integral do microambiente do tecido e a sua presença é essencial para a manutenção de funções fisiológicas, tais como a polarização celular, sobrevivência e proliferação. Aqui apresentamos um método de cultura de tecido 3-dimensional, onde cel medula óssea primárials são cultivadas em matriz extracelular formulado para recapitular o microambiente do osso humano (sistema RBM). Incorporado na matriz extracelular, as células são fornecidos com os nutrientes através do meio suplementado com plasma humano, proporcionando, assim, um sistema global em que a sobrevivência e proliferação das células podem ser mantidas durante 30 dias, mantendo a composição celular do tecido primário. Usando o sistema RBM que cresceram com sucesso de células de medula óssea primárias de dadores normais e de pacientes com amiloidose, e várias doenças malignas hematológicas. O sistema RBM permite a visualização directa, na matriz em tempo real do comportamento celular e da avaliação da eficácia pré-clínico de novas terapias. Além disso, as células podem ser isoladas a partir da RBM e subsequentemente utilizada para a transplantação in vivo, separação de células, citometria de fluxo, e de ácidos nucleicos e a análise de proteínas. Tomados em conjunto, o método RBM fornece um sistema confiável para o crescimento de marro ósseo primáriow células sob condições fisiológicas.
A cultura de tecidos foi desenvolvido para estudar o comportamento de células num ambiente controlado, para minimizar a variabilidade sistémica quando se comparam diversos processos em organismos intactos. Este método foi estabelecido pela primeira vez no início de 1900 e 1,2 se refere a uma técnica onde explantes de tecido foram cultivadas ex vivo em um prato de vidro. Em meados de 1900 o sistema foi adaptado para cultivar células dispersas em vez de fragmentos de tecidos intactos, e 'cultura de tecidos »e de" cultura de células "tornou-se sinônimo 3. Nestes sistemas de cultura celular convencionais células são cultivadas na superfície de plástico de cultura de tecido revestida com meio de crescimento suplementado com vários factores de crescimento. Dois tipos de culturas surgiram com base na capacidade de adesão de várias células: A cultura de células aderentes, em que as células anexar e espalhada sobre o plástico de cultura de tecidos e as culturas não aderentes, em que as células são propagadas em suspensão. Desde os primeiros dias da célulacultura, várias linhas celulares imortais foram criados, tais como HeLa 4, a primeira linha celular de cancro humano. Estas linhas de células têm a capacidade de proliferar indefinidamente em cultura de células, e a maioria não necessitam de qualquer tratamento especial para manter a viabilidade.
A abordagem redutora dos métodos de cultura de células originais foi concebido para simplificar o sistema, tanto quanto possível, incluindo apenas os componentes mínimo necessário para manter a viabilidade e a proliferação celular. No entanto, as abordagens de cultura de células simplificadas não suporta ex vivo a maioria dos tipos de células primárias humanas, com tempo de vida finito. Portanto, os novos sistemas de cultura estão a ser concebidos para aproximar o microambiente do tecido, tanto quanto possível, permitindo assim que explantes de células de crescer sob condições fisiológicas. Em contraste com as abordagens convencionais redutoras / cultura de células, 3-dimensional (3-D) de sistemas de cultura estão agora a tornar-se um método preferido para a cultura de forma eficiente várioslinhas de células humanas e células primárias para estudar posteriormente mecanismos envolvidos na saúde e na doença, no contexto de um microambiente de suporte. Tais sistemas 3-D são normalmente configurados usando matrizes e / ou médio reconstruídos suplementadas com fatores de crescimento, a fim de recapitular o microambiente do tecido para estudar os tipos de células de interesse. O primeiro destes três-dimensional (3-D) modelos de cultura foi desenvolvida para estudar o desenvolvimento da glândula mamaria. Para fornecer as células com condições nativas células epiteliais mamárias foram embutidos em Matrigel, colágeno IV e fonte rica em laminina de matriz extracelular (ECM), e coberto com meio de crescimento. Sob tais condições, as células epiteliais mamárias formado aglomerados que se assemelham a ácinos mamaria, e após estimulação com hormonas lactogênica, estes ácinos secretada caseína, e outras proteínas do leite, no Lumena oco das estruturas acini semelhante. Secreção de caseína não foi observada em culturas convencionais, mesmo após a adição de 5 prolactina, Enfatizando ainda mais o papel do microambiente em preservar as características morfológicas e fenotípicas das células. Outra demonstração da perda da função celular normal, quando as células são retiradas do contexto do seu microambiente fisiológico é uma demonstração que o microambiente sem suporte, queratinócitos não conseguem formar epiderme estratificada 6. Um número de outros modelos de 3-D, foram criados para permitir ex vivo a propagação de células primárias 7,8.
O papel crucial dos microambiente no comportamento celular foi elegantemente demonstrada num estudo em que as células epiteliais mamárias formado "inside-out" ácinos quando cultivadas em matriz de colagénio I, em comparação com os ácinos correctamente polarizado que foram formados em Matrigel. Esta perda de morfologia adequada foi revertido quando as células mioepiteliais produtoras laminina foram adicionados às culturas de colagénio I 9. Além disso, microambiente correcta é necessário para a exactamanifestação genótipo. Crescido em um prato, as células cancerosas da mama MCF7 transfectadas com uma célula-célula molécula de adesão CEACAM1 comportam-se exatamente o mesmo que as células negativas CEACAM untransfected. No entanto, quando cultivadas em Matrigel, em contato com a ECM, estruturas semelhantes a tumores formulário wildtype MCF7 enquanto as células MCF-7 transfectadas com CEACAM1 reverter para um fenótipo e forma ácinos normais com Lumena oco, como tem sido estabelecida com nonmalignant epitélio mamário 10. Da mesma forma, o bloqueio em células de cancro da mama-integrina β1 não alterar o seu comportamento em condições padrão de cultura, mas a mesma experiência realizada em culturas de 3-D demonstra que o bloqueio da integrina β1 reverte células malignas para um fenótipo normal 11. Portanto, microambiente tecido não é apenas necessário para manter a viabilidade das células, mas também para manter o funcionamento adequado das células.
Para além de proporcionar um sistema em que o comportamento de células pode ser estudado sob condições fisiológicass, culturas 3-D funciona meio como robusto e confiável para testes pré-clínicos de novas terapias 8,12,13. A cultura de células em 3-D permite a triagem de compostos de investigação sob as condições do ambiente mediado por droga-resistência 14, onde a contribuição de célula-célula e célula-ECM adesão poderia ser avaliado. Além disso, a toxicidade não-alvo de novos compostos pode ser determinada pela incorporação de múltiplos compartimentos celulares de vários tecidos. Essas telas podem ser realizadas mais rapidamente e são mais rentáveis do que os estudos comparativos in vivo 8.
Aqui apresentamos uma configuração de um modelo 3-D de medula óssea reconstruída (RBM), onde a medula óssea normal e maligno (BM), as células proliferam ex vivo em um sistema que imita de perto o microambiente da BM humano. Tentativas anteriores de crescimento de células primárias BM humanas em culturas de 2-D, líquido ou co-culturas aderentes com vários componentes do estroma BMOu 3-D, as culturas de ágar semi-sólidos tiveram um sucesso limitado devido à sua incapacidade para suprir as células com os componentes do microambiente tecido 15-18. Nestes sistemas de células de MO primários tinham viabilidade pobre e não conseguiram proliferar ex vivo. Um outro sistema em que as células progenitoras BM humanas são cultivadas em co-culturas de esferóide com células estromais da BM é um sistema de 3-D em que a viabilidade e proliferação de células estaminais hematopoiéticas foi mantida durante pelo menos 96 h 19. No entanto, apesar de altamente benéfico para a compreensão da biologia de células progenitoras hematopoiéticas, este sistema não recapitular fielmente o microambiente da BM, devido à ausência de componentes da matriz extracelular, por conseguinte, limita a sua utilidade. O modelo RBM aqui descrito apresenta um sistema global em que ambos os compartimentos celulares e extracelulares da BM humano são reconstruídos in vitro. Mostramos que as culturas RBM pode suportar ex vivo crescimento de células BM humanos normais, como nósll como células isoladas a partir de doentes com vários distúrbios hematológicos.
O modelo RBM fornece um sistema completo onde a composição celular da BM é mantida ex vivo por até 30 dias. BM células cultivadas em RBM auto-estratificar de acordo com a sua função mimetizando a arquitetura BM encontrado in vivo. Além disso, este é o primeiro sistema que permite a expansão do clone de mieloma múltiplo de 8. Os passos mais críticos para assegurar o crescimento robusto de células de MO e o sucesso global da cultura são: 1) para obter uma população saudável da…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Câncer (1R21CA141039), BD Biosciences Research Award Grant, a Sociedade Americana de Câncer Research Grant Institucional (IRG # 58-006-53), para o Centro de Purdue University para o cancro Pesquisa, e do Canadian Institutes of a iniciativas de pesquisa Programa de Alberta Cancer Research Board e Saúde. MP foi apoiado pelo National Institutes of Health, National Cancer Institute, Cancer Prevention Programa de Estágio (R25CA128770; PI: D. Teegarden), administrado pelo Centro de Ciências Oncológicas e do Centro de Pesquisa de Aprendizagem Descoberta da Universidade de Purdue.
CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life technologies | C34554 | |
Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
Vectashield mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
FACSort flow cytometer | BD biosciences | ||
CellQuest Pro software | BD biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |