ثقافة الأنسجة نموذج ثلاثي الأبعاد لدراسة الابتدائية نخاع العظم الإنسان والأورام الخبيثة في
Summary
في طرق الثقافة القياسية تؤخذ خلايا من بيئتهم الفسيولوجية ونمت على سطح البلاستيك من صحن. لدراسة سلوك خلايا نخاع العظام البشرية الأولية أنشأنا نظام الثقافة 3-D حيث تزرع الخلايا تحت الظروف تلخص المكروية مواطن من الأنسجة.
Abstract
وقد تم زراعة الأنسجة أداة لا تقدر بثمن لدراسة جوانب كثيرة من وظيفة الخلية، من التطور الطبيعي للمرض. طرق زراعة الخلايا التقليدية تعتمد على قدرة الخلايا إما أن نعلق على التحتية الصلبة من صحن زراعة الأنسجة أو أن تنمو في تعليق في وسط سائل. وقد تم إنشاء خطوط الخلايا الخالد متعددة ونمت باستخدام هذه النهج، ومع ذلك، تفشل هذه الأساليب في كثير من الأحيان عندما تحتاج الخلايا الأولية التي يمكن زراعتها خارج الحي. ويعزى هذا الفشل إلى عدم وجود مكونات المصفوفة خارج الخلية المناسبة من الأنسجة المكروية من النظم القياسية حيث يتم استخدام البلاستيك زراعة الأنسجة كسطح لنمو الخلايا. المصفوفة خارج الخلية هو جزء لا يتجزأ من النسيج المكروية وجودها أمر بالغ الأهمية للحفاظ على الوظائف الفسيولوجية مثل الاستقطاب الخلية، والبقاء على قيد الحياة، وانتشار الأسلحة النووية. هنا نقدم الأنسجة 3 الابعاد طريقة ثقافة حيث نخاع العظم الأولية سلوتزرع ليرة سورية في المصفوفة خارج الخلية وضعت لألخص المكروية من العظام البشرية (نظام الإدارة القائمة على النتائج). جزءا لا يتجزأ في المصفوفة خارج الخلية، يتم تزويد الخلايا مع المواد المغذية من خلال وسيلة تستكمل مع البلازما البشرية، وبالتالي توفير نظام شامل حيث يمكن أن يستمر بقاء الخلية والانتشار لمدة تصل إلى 30 يوما مع الحفاظ على التركيبة الخلوية من النسيج الأساسي. باستخدام نظام الإدارة القائمة على النتائج لقد نمت بنجاح خلايا نخاع العظام الأولية من المانحين العادية والمرضى الذين يعانون من الداء النشواني، ومختلف الأورام الخبيثة الدموية. يسمح نظام الإدارة القائمة على النتائج لالمباشر، في مصفوفة التصور في الوقت الحقيقي من سلوك الخلية وتقييم فعالية قبل السريرية من علاجات جديدة. علاوة على ذلك، يمكن عزل الخلايا من الإدارة القائمة على النتائج في وقت لاحق واستخدامها لزرع في الجسم الحي، الفرز الخلية، والتدفق الخلوي، وتحليل الحمض النووي والبروتينات. أخذت معا، ويوفر طريقة RBM نظام موثوق لنمو العظام الأولية ماروث الخلايا تحت الظروف الفسيولوجية.
Introduction
وقد تم تطوير زراعة الأنسجة لدراسة سلوك الخلية في بيئة تسيطر عليها للحد من التباين المنهجي عند مقارنة العمليات المختلفة في الكائنات سليمة. تأسست هذه الطريقة لأول مرة في أوائل عام 1900 1،2 ويشير إلى تقنية حيث كانت إإكسبلنتس الأنسجة مثقف فيفو السابقين في طبق زجاجي. في منتصف 1900s تم تعديل النظام لتنمو الخلايا المتفرقة بدلا من شظايا الأنسجة سليمة، وأصبح "زراعة الأنسجة" ومصطلح "ثقافة الخلية مرادفا 3. في مثل هذه الأنظمة زراعة الخلايا التقليدية تزرع الخلايا على سطح البلاستيك زراعة الأنسجة مضافين مع متوسط النمو تستكمل مع عوامل النمو المختلفة. ظهرت نوعين من الثقافات على أساس قدرة التصاق الخلايا المختلفة: زراعة الخلايا الملتصقة، حيث تعلق الخلايا وتنتشر على البلاستيك زراعة الأنسجة والثقافات غير ملتصق، حيث يتم نشر الخلايا في التعليق. منذ الأيام الأولى للخليةوقد تم إنشاء والثقافة، ومتعددة خطوط الخلايا الخالدة، مثل هيلا 4، وأول خط الخلايا السرطانية البشرية. هذه خطوط الخلايا لديها القدرة على التكاثر إلى ما لا نهاية في خلية ثقافة، ومعظمها لا تتطلب أي معاملة خاصة للحفاظ على قدرتها على البقاء.
وقد تم تصميم المنهج الاختزالي الطرق الثقافة الخلية الأصلية إلى تبسيط النظام قدر الإمكان من قبل بما في ذلك المكونات فقط الحد الأدنى المطلوب للحفاظ على بقاء الخلية والانتشار. ومع ذلك، تفشل تبسيط النهج زراعة الخلايا لدعم فيفو السابقين معظم أنواع الخلايا البشرية الأولية مع المتناهي فترة الحياة. لذلك، يجري تصميم نظم ثقافة جديدة لتقريب المكروية الأنسجة بأكبر قدر ممكن، وبالتالي السماح إإكسبلنتس الخلايا أن تنمو في ظل الظروف الفسيولوجية. وعلى النقيض من التقليدية / الاختزالية النهج ثقافة الخلية، 3 الأبعاد (3-D) ونظم الثقافة أصبحت الآن الأسلوب المفضل لثقافة مختلفة بكفاءةخطوط الخلايا البشرية والخلايا الأولية لدراسة الآليات التي تشارك لاحقا في الصحة والمرض، في سياق المكروية داعمة. عادة ما يتم تعيين هذه النظم 3-D حتى باستخدام المصفوفات أعيد بناؤها و / أو متوسطة تستكمل مع عوامل النمو، من أجل ألخص المكروية الأنسجة لدراسة أنواع الخلايا في المصالح. وقد وضعت أول هذه 3 الأبعاد (3-D) نماذج الثقافة لدراسة التنمية الغدة الثديية. لتوفير الخلايا مع الظروف المحلية وجزءا لا يتجزأ من الخلايا الظهارية الثديية في Matrigel، والكولاجين الرابع ومصدر laminin غنية من المصفوفة خارج الخلية (ECM)، ومضافين مع النمو المتوسط. في ظل هذه الظروف، فإن الخلايا الظهارية الثديية شكلت مجموعات تشبه عنيبات الثديية، وعلى التحفيز مع الهرمونات المولد للبن، وهذه عنيبات يفرز الكازين، وبروتينات الحليب الأخرى، في lumena جوفاء من هياكل مثل عنيبات. لم يكن لوحظ إفراز الكازين في الثقافات القياسية حتى بعد إضافة البرولاكتين 5، مزيد من التأكيد على دور المكروية في الحفاظ على الخصائص المورفولوجية والمظهري من الخلايا. دليل آخر على فقدان وظيفة الخلوية العادية عندما تؤخذ خلايا من سياق المكروية بهم الفسيولوجية هو أن مظاهرة دون المكروية داعمة، تفشل الخلايا الكيراتينية لتشكيل البشرة طبقية 6. وقد تم إنشاء عدد من النماذج الأخرى 3-D للسماح فيفو السابقين انتشار الخلايا الأولية 7،8.
وقد تجلى الدور الحاسم للالمكروية في سلوك الخلية ذكية في دراسة الخلايا الظهارية الثديية حيث شكلت "من الداخل إلى الخارج" عنيبات عند تربيتها في الكولاجين أنا المصفوفة، مقارنة عنيبات الاستقطاب بشكل صحيح التي تشكلت في Matrigel. وقد عادت هذه الخسارة من التشكل الصحيح عندما أضيفت خلايا عضلية ظهارية المنتجة laminin على ثقافات الكولاجين أنا 9. علاوة على ذلك، مطلوب المكروية الصحيح للدقيقةراثى مظهر. نمت في طبق، وسرطان الخلايا MCF7 الثدي transfected مع لخلية خلية التصاق جزيء CEACAM1 تتصرف بالضبط نفس الخلايا السلبية CEACAM untransfected. ومع ذلك، عند تربيتها في Matrigel، في اتصال مع ECM، شكل wildtype MCF7 هياكل تشبه الورم في حين أن الخلايا MCF7 transfected مع CEACAM1 العودة إلى النمط الظاهري والنموذج العادي عنيبات مع lumena جوفاء، كما أنشئت مع غير خبيثة ظهارة الثديية 10. وبالمثل، حظر في خلايا سرطان الثدي إنتغرين β1 لا يغير سلوكهم في ظل ظروف ثقافة القياسية، ولكن نفس التجربة التي أجريت في الثقافات 3-D يوضح أن حجب β1-إنتغرين يعود الخلايا الخبيثة إلى النمط الظاهري العادي 11. وبالتالي، ليس مطلوبا المكروية الأنسجة فقط للحفاظ على بقاء الخلية، ولكن أيضا للاحتفاظ ظيفة الخلايا السليمة.
بالإضافة إلى توفير نظام حيث يمكن دراسة سلوك الخلية تحت ظروف فسيولوجيةق والثقافات 3-D بشكل المتوسطة وقوية وموثوق بها للاختبار قبل السريرية لعلاجات جديدة 8،12،13. زراعة خلايا في 3-D يسمح فحص مجمعات الفحص في ظل ظروف البيئة بوساطة العقاقير المقاومة 14، حيث يمكن تقييم مساهمة خلية خلية وخلية التصاق ECM. علاوة على ذلك، بعيدا عن الهدف سمية مركبات جديدة يمكن التأكد من خلال دمج مقصورات الخلوية متعددة من الأنسجة المختلفة. هذه الشاشات يمكن أن يؤديها بسرعة أكبر وأكثر من الدراسات المماثلة في الجسم الحي 8 فعالة من حيث التكلفة.
هنا نقدم الإعداد لنموذج 3-D من نخاع العظام أعيد بناؤها (RBM) حيث تتكاثر العادية والخبيثة نخاع العظم (BM) الخلايا فيفو السابقين في نظام محاكاة عن كثب المكروية من BM الإنسان. المحاولات السابقة في تزايد الخلايا الأولية BM الإنسان في الثقافات 2-D، سائلة أو cocultures ملتصقة مع مختلف مكونات BM سدى، أو 3-D، وقد اجتمع الثقافات أجار شبه صلبة مع نجاح محدود نظرا لعدم قدرتها على تزويد الخلايا التي تحتوي على مكونات الأنسجة المكروية 15-18. في هذه النظم زيارتها الخلايا الأولية BM الفقراء جدوى وفشلت في الانتشار خارج الحي. نظام آخر حيث تزرع الخلايا الاصلية BM الإنسان في cocultures كروي مع الخلايا اللحمية BM هو نظام 3-D حيث أصيب بقاء الخلية الجذعية المكونة للدم وانتشار لمدة 96 ساعة على الأقل 19. ومع ذلك، على الرغم مفيد للغاية لفهم السلف الأحياء المكونة للدم، وهذا النظام لا ألخص بأمانة المكروية من BM نظرا لعدم وجود مكونات ECM، وبالتالي، يحد من فائدته. نموذج الإدارة القائمة على النتائج الموضحة هنا يقدم نظاما شاملا حيث يتم بناؤها على حد سواء مقصورات الخلوية وخارج الخلية من BM الإنسان في المختبر. وتبين لنا أن الثقافات الإدارة القائمة على النتائج يمكن أن تدعم فيفو السابقين نمو الخلايا BM الإنسان العادي، ونحنليرة لبنانية باسم خلايا معزولة من المرضى الذين يعانون من مختلف الاضطرابات الدموية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر نموذج الإدارة القائمة على النتائج نظاما شاملا حيث يتم الاحتفاظ تكوين الخلوية من BM فيفو السابقين لمدة تصل إلى 30 يوما. BM الخلايا المزروعة في الإدارة القائمة على النتائج الذاتي تطبق وفقا لوظيفتها محاكاة عن كثب العمارة BM جدت في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للسرطان (1R21CA141039)، BD جائزة العلوم البيولوجية منحة بحثية، والبحوث المؤسسية جمعية السرطان الأمريكية غرانت (IRG # 58-006-53)، إلى مركز جامعة بوردو للسرطان البحوث، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة، وبرنامج المبادرات بحوث السرطان مجلس ألبرتا. وأيد النائب من قبل المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للسرطان، وبرنامج التدريب الداخلي الوقاية من السرطان (R25CA128770؛ PI: D. Teegarden) من قبل مركز علوم الأورام ومركز الأبحاث التعلم ديسكفري في جامعة بوردو تدار.
Materials
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| Vectashield mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
- Carrel, A. On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism. J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).
- Harrison, R. G. Observations on the living developing nerve fiber. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).
- Earle, W. R. Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. J. Natl. Cancer Inst. 4, 165-212 (1943).
- Gey, G. O., Coffman, W. D., Kubicek, M. T. Tissue Culture Studies of the Proliferative Capacity of Cervical Carcinoma and Normal Epithelium. Cancer Res. 12, 264-265 (1952).
- Barcelloshoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional-Differentiation and Alveolar Morphogenesis of Primary Mammary Cultures on Reconstituted Basement-Membrane. Development. 105, 223-227 (1989).
- Lamb, R., Ambler, C. A. Keratinocytes propagated in serum-free, feeder-free culture conditions fail to form stratified epidermis in a reconstituted skin model. PloS One. 8, (2013).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q. Z., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion. Int. J. Exp. Pathol. 86, 365-374 (2005).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. J. Cell Sci. 115, 39-50 (2002).
- Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 100, 521-526 (2003).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Gunn, E. J., et al. The natural products parthenolide and andrographolide exhibit anti-cancer stem cell activity in multiple myeloma. Leukemia Lymphoma. 52, 1085-1097 (2011).
- Hsiao, A. Y., et al. 384 hanging drop arrays give excellent Z-factors and allow versatile formation of co-culture spheroids. Biotechnol. Bioeng. 109, 1293-1304 (2012).
- Meads, M. B., Gatenby, R. A., Dalton, W. S. Environment-mediated drug resistance: a major contributor to minimal residual disease. Nat. Rev. Cancer. 9, 665-674 (2009).
- Golde, D. W., Cline, M. J. Growth of Human Bone-Marrow in Liquid Culture. Blood. 41, 45-57 (1973).
- Gartner, S., Kaplan, H. S. Long-Term Culture of Human-Bone Marrow-Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. Biol. 77, 4756-4759 (1980).
- Caligaris-Cappio, F., et al. Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma. Blood. 77, 2688-2693 (1991).
- Pike, B. L., Robinson, W. A. Human bone marrow colony growth in agar-gel. J. Cell. Physiol. 76, 77-84 (1970).
- Bug, G., et al. Rho family small GTPases control migration of hematopoietic progenitor cells into multicellular spheroids of bone marrow stroma cells. J. Leukocyte Biol. 72, 837-845 (2002).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, (2006).
- Tancred, T. M., Belch, A. R., Reiman, T., Pilarski, L. M., Kirshner, J. Altered Expression of Fibronectin and Collagens I and IV in Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance. J. Histochem. Cytochem. 57, 239-247 (2009).
