בשיטות סטנדרטיות תרבות תאים נלקחים מתוך הסביבה הפיזיולוגית שלהם וגדלו על משטח הפלסטיק של מנה. כדי לחקור את התנהגותם של תאים במח עצם אנושיים ראשוניים שיצרנו מערכת תרבות 3-D בו תאים גדלים בתנאים משחזרים microenvironment יליד הרקמות.
תרבית רקמה הייתה כלי רב ערך כדי ללמוד על היבטים רבים של תפקוד תא, מהתפתחות נורמלית למחלה. שיטות תרבות תאים רגילות להסתמך על היכולת של תאים או לצרף לתשתית מוצקה של צלחת תרבית רקמה או לגדול בתרחיף במדיום נוזלי. נוצרו שורות תאים אלמותיים מרובות וגדלו תוך שימוש בגישות אלה, עם זאת, שיטות אלה לעתים קרובות להיכשל כאשר תאים ראשוניים צריכים להיות מבוגרים vivo לשעבר. כישלון כזה יוחס להעדרם של רכיבי מטריצה תאיים המתאימים של microenvironment הרקמה מהמערכות סטנדרטיות שבו פלסטיק תרבית רקמה משמש כמשטח לצמיחת תאים. מטריצה תאית היא מרכיב בלתי נפרד של microenvironment הרקמות ונוכחותה היא חיונית לשמירה על תפקודים פיסיולוגיים כגון קיטוב תא, הישרדות, ושגשוגם. כאן אנו מציגים שיטת תרבית רקמה 3 ממדים שבו cel מוח עצם העיקריls גדלים במטריצה תאית גובשה כדי לשחזר את microenvironment של עצמות אדם (מערכת RBM). משובץ במטריצה תאית, תאים מסופקים עם חומרים מזינים דרך המדיום בתוספת פלזמה אנושית, ובכך לספק מערכת מקיפה שבו הישרדות תא ושגשוגם יכולים להתקיים לעד 30 ימים תוך שמירה על ההרכב התאי של הרקמות ראשוניות. שימוש במערכת RBM יש לנו גדלו בהצלחה תאי מח העצם עיקריים מתורמים רגילים וחולים עם עמילואידוזיס, ומחלות דם ממאירות שונות. מערכת RBM מאפשרת הדמיה ישירה, במטריצה בזמן אמת של התנהגות התא וההערכה של יעילות קליני של תרופות חדשות. יתר על כן, ניתן לבודד תאים מRBM ולאחר מכן נעשה שימוש להשתלת in vivo, מיון תא, cytometry זרימה, וחומצות גרעין וניתוח חלבון. יחדיו, שיטת RBM מספקת מערכת אמינה לצמיחה של Marro עצם העיקריתאי w בתנאים פיסיולוגיים.
תרבית רקמה פותחה כדי ללמוד על התנהגות תא בסביבה מבוקרת כדי למזער את ההשתנות המערכתית כאשר משווה תהליכים שונים באורגניזמים שלמים. שיטה זו הוקמה לראשונה ב 1900 1,2 המוקדם ומתייחסת לטכניקה שבה explants היה בתרבית הרקמה vivo לשעבר בצלחת זכוכית. באמצע שנתי ה 1900s-המערכת הותאמה לגדל תאים מפוזרים ולא שברי רקמות שלמות, ו'תרבית הרקמה 'התנאים ו'תרבית תאים' הפכו לשם נרדף 3. במערכות תרבית תאים קונבנציונליות כגון תאים גדלים על פני השטח של הפלסטיק בתרבית רקמה ועליהן מדיום גידול בתוספת גורמי גדילה שונים. שני סוגים של תרבויות צמחו מבוססים על יכולת ההדבקה של תאים שונים: תרבית תאים חסיד, שבו תאים לצרף ולהפיץ על הפלסטיק בתרבית רקמה ותרבויות nonadherent, שבו תאים מופצים בהשעיה. מאז הימים הראשונים של תאנוצרו תרבות, שורות תאים אלמותיים מרובות, כגון 4 הלה, שורת תאי סרטן האנושיים הראשונה. יש שורות תאים אלה את היכולת להתרבות ללא הגבלת זמן בתרבית תאים, ורוב אינו דורשים כל טיפול מיוחד כדי לשמור על יכולת קיום.
הגישה הרדוקציוניסטית של שיטות תרבית תאים המקורית שנועדה לפשט את המערכת ככל האפשר על ידי כולל רק את רכיבי המינימום הנדרשים כדי לקיים את כדאיות תא ושגשוגם. עם זאת, גישות פשוטות תרבית תאים לא מצליחות לתמוך vivo לשעבר סוגים העיקריים ביותר תא אנושיים עם תוחלת חיים מוגבלת. לכן, מערכות התרבות חדשות שתוכננו משוערת microenvironment הרקמות, ככל שניתן, ובכך מאפשרות explants התא לגדול בתנאים פיסיולוגיים. בניגוד ל/ גישות קונבנציונליות הרדוקציוניסטית תרבית תאים, 3 ממדים (3-D) מערכות תרבות נמצאות כעת הופכות שיטה מועדפת ליעילות תרבות שונותשורות תאים אנושיות ותאים ראשוניים ללמוד לאחר מכן מנגנונים מעורבים במחלה ובריאות, בהקשר של microenvironment תומך. מערכות 3-D כאלה הן בדרך כלל הגדרה באמצעות מטריצות משוחזרות ו / או בינוני בתוספת גורמי גדילה, על מנת לשחזר את microenvironment הרקמות ללמוד סוגי תא של עניין. הראשון של דגמי תרבות 3 ממדים (3-D) אלה פותח כדי ללמוד התפתחות בלוטת החלב. כדי לספק את התאים עם תנאים מקומיים תאי אפיתל החלב היו משובצים בMatrigel, קולגן IV ומקור laminin עשיר של מטריצה תאית (ECM), ועליהן מדיום גידול. בתנאים אלה, תאי אפיתל החלב נוצרו אשכולות דומים acini החלב, ועל גירוי עם הורמוני lactogenic, acini אלה מופרשים קזאין, וחלבונים חלב אחרים, לlumena החלול של המבנים דמוי acini. הפרשת קזאין לא נצפתה בתרבויות סטנדרטיות גם לאחר תוספת של פרולקטין 5, תוך שימת דגש על תפקידו של המיקרו בשמירה על המאפיינים מורפולוגיים ופנוטיפי של תאים נוספים. הפגנה נוספת של אובדן התפקוד תאי נורמלי כאשר תאי לקוחים מתוך ההקשר של microenvironment הפיזיולוגי שלהם היא הפגנה שללא microenvironment תומך, קרטינוציטים להיכשל כדי ליצור האפידרמיס מרובדת 6. מספר 3-D מודלים אחרים נוצר כדי לאפשר ריבוי vivo לשעבר של תאים ראשוניים 7,8.
התפקיד המכריע של microenvironment בהתנהגות תא הודגם אלגנטיות במחקר שבו תאי אפיתל החלב נוצרו acini "מבפנים החוצה" כאשר בתרבית בקולגן אני מטריקס, בהשוואה לacini המקוטב בצורה הנכונה שנוצרו בMatrigel. הפסד זה של מורפולוגיה התקינה היה חזר כאשר תאי myoepithelial ייצור laminin נוספו לקולגן I תרבויות 9. יתר על כן, microenvironment הנכון דרוש למדויקביטוי גנוטיפ. גדל בצלחת, תאי סרטן שד MCF7 transfected עם CEACAM1 מולקולת הידבקות תאי תאים מתנהגים בדיוק כמו התאים השליליים CEACAM untransfected. עם זאת, כאשר בתרבית בMatrigel, במגע עם ECM, מבנים כמו גידול בצורת MCF7 wildtype תוך MCF7 תאי transfected עם CEACAM1 לחזור לacini פנוטיפ והצורה נורמלי עם lumena החלול, כפי שכבר נקבעו באפיתל החלב nonmalignant 10. בדומה לכך, חסימה בתאי סרטן שד integrin-β1 אינו משנה את התנהגותם בתנאי תרבות סטנדרטיות, אבל על אותו הניסוי שבוצע בתרבויות 3-D מוכיח כי חסימת β1-integrin חוזרת תאים ממאירים לפנוטיפ נורמלי 11. לכן, microenvironment רקמות אינו נדרש רק כדי לשמור על כדאיות תא, אלא גם כדי לשמור על תפקוד תא תקין.
בנוסף לאספקת מערכת שבה התנהגות תא ניתן ללמוד בתנאים פיסיולוגייםים, תרבויות 3-D לתפקד מדיום חזק ואמין כמו לבדיקה קליני של הרפוי רומן 8,12,13. Culturing תאים ב 3-D מאפשר הקרנה של תרכובות investigational בתנאים של בתיווך סביבת סמים התנגדות 14, שבו התרומה של תאי תאים והידבקות התא-ECM יכולה להיות מוערכת. יתר על כן, רעילות מחוץ היעד של תרכובות חדשות ניתן לקביעה על ידי שילוב של תאים סלולריים שונים של רקמות שונות. ניתן לבצע מסכים כאלה במהירות רבה יותר ויותר יעיל וחסכוני יותר מהמחקרים דומים בvivo 8.
כאן אנו מציגים התקנה של 3-D מודל של מח עצם משוחזר (RBM) שבו תאי מח עצם נורמלי וממאירים (BM) להתרבות vivo לשעבר במערכת מחקה את microenvironment של BM האדם באופן הדוק. ניסיונות קודמים בגידול תאי BM אנושי ראשוניים בתרבויות 2-D, נוזל או cocultures חסיד עם רכיבים שונים של stroma BM, או 3-D, תרבויות אגר חצי מוצק נפגשו עם הצלחה מוגבלת בשל חוסר היכולת שלהם לספק את התאים עם הרכיבים של microenvironment הרקמה 15-18. במערכות אלה היו תאי BM עיקריים כדאיות עניות ולא הצליחו להתרבות vivo לשעבר. מערכת נוספת שבו תאי BM אדם גדלים בcocultures אליפטית עם תאי סטרומה BM היא מערכת 3-D בו כדאיות תא גזע hematopoietic ושגשוגם נשמרו במשך לפחות 96 שעה 19. עם זאת, למרות שמאוד מועיל להבנת הביולוגיה אבות היווצרות הדם, מערכת זו אינה נאמנות לשחזר את microenvironment של BM בשל היעדר רכיבי ECM, ולכן, מה שמגביל את השימושיות שלה. דגם RBM המתואר כאן מציג מערכת מקיפה שבו שני התאים סלולריים ותאיים של BM האדם משוחזרים במבחנה. אנו מראים כי תרבויות RBM יכולות לתמוך בצמיחת vivo לשעבר של תאים אנושיים BM רגילים, כפי שאנוll כמו תאים מבודדים מחולים עם הפרעות המטולוגיות שונות.
דגם RBM מספק מערכת מקיפה שבו הרכב תאי של BM נשמר vivo לשעבר לתקופה של עד 30 ימים. תאי BM גדלו בRBM עצמי רבד פי הפונקציה שלהם מחקה את ארכיטקטורת BM מצאה in vivo בשיתוף פעולה הדוק. יתר על כן, זוהי המערכת הראשונה המאפשרת להרחבת שיבוט מיאלומה הנפוצה 8. השלבים הקריטיים ביו…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות, המכון לאומי לסרטן (1R21CA141039), BD Biosciences מענק מחקר פרס, האגודה האמריקנית לסרטן המחקר המוסדי גרנט (IRG # 58-006-53), למרכז אוניברסיטת פרדו למלחמה בסרטן מחקר, והמכון הקנדי לבריאות מחקר והתכנית ליוזמות מחקר אלברטה סרטן הדירקטוריון. חבר הפרלמנט נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות, המכון לאומי לסרטן, תכנית למניעת סרטן התמחות (R25CA128770; PI: ד טיגרדן) מנוהל על ידי המרכז למדעי אונקולוגית ומרכז המחקר למידה הגילוי באוניברסיטת פרדו.
CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life technologies | C34554 | |
Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
Vectashield mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
FACSort flow cytometer | BD biosciences | ||
CellQuest Pro software | BD biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |