A Tissue Culture Modèle tridimensionnel pour étudier primaire moelle osseuse humaine et de ses affections malignes
Summary
Dans les procédés de culture standards cellules sont retirées de leur environnement physiologique et cultivées sur la surface en plastique d'un plat. Pour étudier le comportement de cellules primaires de moelle osseuse humaine, nous avons créé un système de culture en 3-D, où les cellules sont cultivées dans des conditions récapitulant le microenvironnement du tissu natif.
Abstract
La culture de tissus a été un outil précieux pour étudier de nombreux aspects de la fonction de la cellule, du développement normal de la maladie. Les méthodes de culture cellulaire classiques reposent sur la capacité des cellules, soit à attacher à un substrat solide d'une boîte de culture tissulaire ou de croître en suspension dans un milieu liquide. Des lignées de cellules immortelles multiples ont été créées et cultivées à l'aide de telles approches, cependant, ces méthodes ne parviennent souvent lorsque des cellules primaires besoin d'être cultivées ex vivo. Un tel échec a été attribué à l'absence de composants de la matrice extracellulaire appropriées du micro-environnement tissulaire à partir des systèmes classiques où la culture de tissu en plastique est utilisé en tant que surface pour la croissance cellulaire. La matrice extracellulaire est un composant intégral de la micro-environnement tissulaire et sa présence est indispensable pour le maintien des fonctions physiologiques telles que la polarisation des cellules, la survie et la prolifération. Nous présentons ici une méthode de culture des tissus en 3 dimensions où cel os primaire de la moellels sont cultivées dans une matrice extracellulaire formulé pour récapituler le microenvironnement de la moelle humaine (système RBM). Incorporé dans la matrice extracellulaire, les cellules sont alimentées en nutriments à travers le milieu supplémenté avec du plasma humain, fournissant ainsi un système complet où la survie et la prolifération cellulaires peuvent être maintenues pendant jusqu'à 30 jours, tout en maintenant la composition cellulaire du tissu primaire. En utilisant le système FrP nous avons développé avec succès des cellules de moelle osseuse provenant de donneurs normaux primaires et les patients atteints d'amylose, et diverses hémopathies malignes. Le système permet FrP directe pour la visualisation en temps réel, dans la matrice du comportement cellulaire et évaluation de l'efficacité préclinique de nouveaux agents thérapeutiques. De plus, les cellules peuvent être isolées à partir de la GR et ensuite utilisés pour la transplantation in vivo, le tri cellulaire, cytométrie de flux, et de l'acide nucléique et l'analyse des protéines. Pris dans leur ensemble, le procédé FrP fournit un système fiable pour la croissance de l'os primaire Marrow cellules dans des conditions physiologiques.
Introduction
La culture de tissus a été développé pour étudier le comportement des cellules dans un environnement contrôlé pour minimiser la variabilité systémique lorsque l'on compare différents processus dans les organismes intacts. Cette méthode a été créé dans le début des années 1900 et 1,2 réfère à une technique où explants de tissus ont été cultivées ex vivo dans un plat en verre. Au milieu des années 1900 le système a été adapté pour cultiver des cellules dispersées plutôt que des fragments de tissus intacts, et de la culture de tissus »et de« culture cellulaire »est devenu synonyme de 3. Dans de tels systèmes de culture de cellules classiques cellules sont cultivées sur la surface de la matière plastique de culture de tissu recouvert avec un milieu de croissance supplémenté avec divers facteurs de croissance. Deux types de cultures sont apparues sur la base de la capacité d'adhérence de cellules différentes: la culture de cellules adhérentes, dans laquelle les cellules se fixent et se répandent sur le plastique de culture de tissus et les cultures non adhérentes, où les cellules sont propagées en suspension. Depuis les premiers jours de celluleculture, plusieurs lignées de cellules immortelles ont été créées, telles que les cellules HeLa 4, la première ligne de cellules de cancer humain. Ces lignées cellulaires sont capables de proliférer indéfiniment en culture cellulaire, et la plupart ne nécessitent pas de traitement spécial pour maintenir la viabilité.
L'approche réductionniste des méthodes de culture de cellules d'origine a été conçu pour simplifier le système autant que possible en incluant uniquement les composants minimum requis pour maintenir la viabilité et la prolifération cellulaire. Cependant, les approches de culture de cellules ne parviennent pas à soutenir simplifiées ex vivo la plupart des types de cellules humaines primaires avec durée de vie finie. Par conséquent, de nouveaux systèmes de culture sont conçus pour se rapprocher autant que possible le microenvironnement tissulaire, permettant ainsi explants cellulaires de se développer dans des conditions physiologiques. Contrairement aux approches traditionnelles réductrices / de culture cellulaire, en 3 dimensions (3-D) des systèmes de culture sont en train de devenir une méthode privilégiée pour la culture efficacement diversdes lignées cellulaires humaines et des cellules primaires d'étudier les mécanismes impliqués dans la suite, la santé et la maladie, dans le contexte d'un micro-environnement favorable. Ces systèmes 3-D sont généralement mis en place en utilisant des matrices et / ou reconstruits milieu supplémenté avec des facteurs de croissance, afin de récapituler le microenvironnement tissulaire pour étudier les types d'intérêt cellulaires. Le premier de ces trois dimensions (3-D) des modèles de culture a été développé pour étudier le développement de la glande mammaire. À fournir des cellules avec des conditions natives des cellules épithéliales mammaires ont été incorporés dans le Matrigel, le collagène IV et la source de la matrice extracellulaire (ECM), de la laminine-riche, et recouvert avec un milieu de croissance. Dans ces conditions, les cellules épithéliales mammaires formés grappes ressemblant acini mammaire, et lors d'une stimulation avec des hormones lactogènes, ces acini sécrétées caséine et d'autres protéines du lait, en l'lumena creux des structures d'acini-like. Caséine sécrétion n'a pas été observée dans les cultures classiques, même après plus de prolactine 5, Mettant l'accent sur le rôle des micro-en préservant les caractéristiques morphologiques et phénotypiques des cellules. Une autre démonstration de la perte de la fonction cellulaire normale lorsque les cellules sont retirées du cadre de leur micro-environnement physiologique est une démonstration que sans micro-environnement favorable, les kératinocytes ne parviennent pas à former épiderme stratifié 6. Un certain nombre d'autres modèles 3-D ont été créés pour permettre aux ex vivo propagation de cellules primaires 7,8.
Le rôle crucial des micro-environnement dans le comportement des cellules a été élégamment démontrée dans une étude où les cellules épithéliales mammaires formés "inside-out" acini lorsqu'elles sont cultivées dans du collagène I matriciel, par rapport à la acini correctement polarisé qui ont été formés dans le Matrigel. Cette perte de la morphologie correcte s'est inversée lorsque les cellules myoépithéliales laminine productrices ont été ajoutés aux cultures de collagène I 9. En outre, microenvironnement correct est nécessaire pour la précisiongénotype manifestation. Cultivées dans un plat, des cellules de cancer du sein MCF7 transfectées avec une cellule-cellule molécule d'adhésion CEACAM1 se comportent exactement les mêmes que les cellules négatives de CEACAM non transfectées. Toutefois, lorsqu'elles sont cultivées en Matrigel, en contact avec ECM structures ressemblant à des tumeurs, de forme de type sauvage MCF7 tandis que les cellules MCF7 transfectées avec CEACAM1 reviennent à un phénotype et forme acini normale avec lumena creux, comme cela a été établi avec l'épithélium mammaire bénigne 10. De même, le blocage de l'intégrine β1-dans les cellules cancéreuses du sein ne modifie pas leur comportement dans des conditions de culture standard, mais la même expérience réalisée dans des cultures en 3-D montre que le blocage de l'intégrine β1-revient des cellules malignes à un phénotype normal 11. Par conséquent, les micro-environnement tissulaire n'est pas seulement nécessaire pour maintenir la viabilité des cellules, mais également de conserver un fonctionnement correct des cellules.
En plus de fournir un système dans lequel le comportement des cellules peut être étudiée dans des conditions physiologiquess, cultures 3-D fonctionner comme moyen robuste et fiable pour les essais précliniques de nouveaux traitements 8,12,13. La culture de cellules en 3-D permet le criblage de composés expérimentaux dans les conditions de l'environnement médiation pharmacorésistance 14, où la contribution de la cellule-cellule et cellule-ECM adhésion pourrait être évaluée. En outre, la toxicité hors cible de nouveaux composés peut être déterminée par incorporation de multiples compartiments cellulaires de différents tissus. Ces écrans peuvent être effectuées plus rapidement et sont plus rentables que les études comparables in vivo 8.
Nous présentons ici une configuration d'un modèle 3-D de reconstitution de la moelle osseuse (RBM) où les cellules normales et malignes de la moelle osseuse (BM) prolifèrent ex vivo dans un système imitant de près le microenvironnement de la BM humaine. Les précédentes tentatives de culture de cellules primaires humaines BM dans les cultures 2-D, liquide ou co-cultures adhérentes avec diverses composantes de la BM stromaOu 3-D, des cultures d'agar semi-solides ont rencontré un succès limité en raison de leur incapacité à fournir les cellules avec les composants du micro-environnement tissulaire de 15 à 18. Dans ces systèmes, les cellules BM primaires avaient une mauvaise viabilité et n'ont pas réussi à proliférer ex vivo. Un autre système dans lequel les cellules progénitrices BM humaines sont cultivées dans les co-cultures avec des sphéroïdes cellules stromales BM est un système 3-D, où la viabilité des cellules souches hématopoïétiques et la prolifération a été maintenue pendant au moins 96 h 19. Cependant, bien que très bénéfique pour la compréhension de la biologie progéniteur hématopoïétique, ce système ne récapituler pas fidèlement le micro-environnement de la BM en raison de l'absence de composants de la MEC, par conséquent, ce qui limite son utilité. Le modèle décrit ici FrP présente un système complet où les deux compartiments cellulaires et extracellulaires de la BM humaine sont reconstruits in vitro. Nous montrons que les cultures RBM peut soutenir la croissance ex vivo de cellules BM humains normaux, comme nousll que les cellules isolées de patients atteints de divers troubles hématologiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le modèle FrP fournit un système complet où la composition cellulaire de la BM est maintenue ex vivo pendant 30 jours. BM cellules cultivées dans FrP auto-stratifier selon leur fonction imitant de près l'architecture BM trouvé in vivo. En outre, il s'agit du premier système qui permet l'expansion de l'myélome multiple clone 8. Les étapes les plus critiques pour assurer la croissance robuste des cellules BM et le succès global de la culture sont les suivantes: 1) pou…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par des subventions des Instituts nationaux de la santé, Institut national du cancer (1R21CA141039), BD Biosciences Subvention de recherche, la subvention de la Société américaine du cancer recherche institutionnelle (IRG # 58-006-53), au Centre de l'Université de Purdue pour le cancer recherche, et les Instituts du programme Initiatives de recherche Alberta Cancer Board de recherche en santé du Canada. MP a été soutenu par le National Institutes of Health, National Cancer Institute, Programme de stages de prévention du cancer (R25CA128770; PI: D. Teegarden) administré par le Centre des sciences oncologique et le Centre de recherche Discovery Learning à l'Université Purdue.
Materials
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| Vectashield mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
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