Eine dreidimensionale Zellkulturmodell zu primären humanen Knochenmark und seine Malignome Studieren
Summary
In Standardkulturverfahren, Zellen aus ihrer physiologischen Umgebung genommen und auf die Kunststoffoberfläche einer Schale gezüchtet. Um das Verhalten von primären humanen Knochenmarkzellen untersuchen wir eine 3-D-Kultur-System, wo Zellen unter Bedingungen rekapituliert die native Mikroumgebung des Gewebes gewachsen erstellt.
Abstract
Gewebekultur ist ein wertvolles Werkzeug, um viele Aspekte der Zellfunktion zu untersuchen, von der normalen Entwicklung für Krankheiten. Herkömmliche Zellkulturverfahren beruhen auf der Fähigkeit von Zellen, entweder an einem festen Substrat einer Gewebekulturschale befestigen oder in Suspension in einem flüssigen Medium wachsen. Mehrere wurden unsterbliche Zelllinien erstellt und aufgewachsen mit solchen Ansätzen, aber diese Methoden häufig scheitern, wenn Primärzellen brauchen, um ex vivo kultiviert werden. Ein solches Versagen ist das Fehlen von geeigneten extrazellulären Matrixkomponenten des Gewebemikroumgebung von den Standardsystemen, bei denen Gewebekultur-Plastik ist als Oberfläche für Zellwachstum eingesetzt zurückzuführen. Extrazelluläre Matrix ist ein integraler Bestandteil der Gewebemikroumgebung und die Präsenz von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der physiologischen Funktionen, wie Zellpolarisation, das Überleben und die Proliferation ist. Hier präsentieren wir eine 3-dimensionale Gewebekultur-Methode, bei der primären Knochenmark-cells sind in der extrazellulären Matrix formuliert, um die Mikroumgebung des menschlichen Knochen (RBM-System) rekapitulieren gewachsen. Eingebettet in der extrazellulären Matrix werden die Zellen mit Nährstoffen durch das Medium, ergänzt mit Humanplasma zugeführt wird, wodurch ein umfassendes System, bei dem das Überleben der Zelle und die Proliferation kann für bis zu 30 Tage aufrechterhalten werden, während die zelluläre Zusammensetzung des primären Gewebes. Mit der rBM System haben wir erfolgreich primäre Knochenmarkszellen von normalen Spendern und Patienten mit Amyloidose und verschiedenen hämatologischen Malignomen gewachsen. Die rBM System ermöglicht direkte, in-Matrix Echtzeit-Visualisierung des Zellverhaltens und Bewertung von präklinischen Wirksamkeit neuer Therapeutika. Darüber hinaus können Zellen aus dem rBM isoliert und anschließend zur in vivo-Transplantation, Zellsortierung, Durchflusszytometrie und Nukleinsäure-und Proteinanalyse. Zusammengenommen stellt die rBM Verfahren ein zuverlässiges System für das Wachstum von primären Knochen marrow Zellen unter physiologischen Bedingungen.
Introduction
Gewebekultur wurde entwickelt, um das Verhalten der Zelle in einer kontrollierten Umgebung zu studieren, um die Variabilität zu minimieren, wenn systemische Vergleich verschiedener Prozesse in intakten Organismen. Diese Methode wurde erstmals im Jahr 1900 1,2 festgelegt und bezieht sich auf eine Technik, bei der Gewebe-Explantate wurden in eine Glasschale kultiviert ex vivo. In der Mitte der 1900er Jahre wurde das System angepasst, um verstreuten Zellen eher als Fragmente intakter Gewebe wachsen, und die Begriffe "Gewebekultur" und "Zellkultur" wurde zum Synonym für drei. Bei solchen herkömmlichen Zellkultursystemen Zellen auf der Oberfläche der Gewebekultur-Plastik mit Wachstumsmedium mit verschiedenen Wachstumsfaktoren überlagert gewachsen. Adhärenten Zellkultur, in der Zellen anlagern und ausbreiten auf der Gewebekultur-Kunststoff und nicht-adhärenten Kulturen, wo Zellen in Suspension propagiert: Zwei Arten von Kulturen haben auf der Grundlage der Haftfähigkeit von verschiedenen Zellen entstanden. Seit den frühen Tagen des ZellEs wurden Kultur verschiedenen unsterblichen Zelllinien wie HeLa-4, der ersten menschlichen Krebszelllinie. Diese Zelllinien haben die Fähigkeit, auf unbestimmte Zeit in Zellkultur zu vermehren, und die meisten keine spezielle Behandlung erforderlich, um die Lebensfähigkeit zu erhalten.
Die reduktionistische Ansatz der ursprünglichen Zellkulturverfahren wurde entwickelt, um das System so weit wie möglich, indem die erforderlich ist, um die Lebensfähigkeit der Zellen und die Proliferation aufrecht Minimum Komponenten vereinfachen. , Vereinfachte Zellkultur Ansätze scheitern jedoch ex vivo meisten primären humanen Zelltypen mit begrenzter Lebensdauer unterstützen. Daher neue Kultursysteme werden entwickelt, um die Gewebemikroumgebung so eng wie möglich anzunähern, wodurch Zell Explantate unter physiologischen Bedingungen zu wachsen. Im Gegensatz zu den herkömmlichen / Reduktionist Zellkulturansätze, 3-dimensionale (3-D) werden nun Kultursystemen zu einem bevorzugten Verfahren, um effizient verschiedene Kulturmenschlichen Zelllinien und Primärzellen anschließend untersuchen Mechanismen in Gesundheit und Krankheit beteiligt sind, im Rahmen einer Mikroumgebung. Solche 3-D-Systeme sind in der Regel mit rekonstruierten Matrizen und / oder Medium mit Wachstumsfaktoren gesetzt, um die Gewebe-Mikroumgebung zu rekapitulieren, um Zelltypen von Interesse studieren. Die erste dieser 3-dimensionalen (3-D) Kulturmodelle entwickelt, um Brustdrüsenentwicklung zu untersuchen. Um die Zellen mit nativen Bedingungen Brustepithelzellen in Matrigel eingebettet, Collagen IV und Laminin-reiche Quelle von extrazellulärer Matrix (ECM) zu schaffen, und bedeckt mit Wachstumsmedium. Unter solchen Bedingungen, bildeten die Mamma-Epithelzellen Cluster ähnlich der Brust Acini und nach Stimulation mit laktogene Hormone, diese Azini sezerniert Kasein, Milchproteine und andere, in den Hohl Lumena der Acini artige Strukturen. Casein-Sekretion wurde nicht in Standard-Kulturen auch nach Zugabe von Prolaktin 5 beobachtetWeitere Betonung der Rolle der Mikroumgebung bei der Erhaltung der morphologischen und phänotypischen Eigenschaften von Zellen. Eine weitere Demonstration der Verlust der normalen Zellfunktion, wenn die Zellen aus dem Kontext ihrer physiologischen Mikroumgebung genommen ist eine Demonstration, dass ohne Mikroumgebung, Keratinozyten nicht, geschichtete Epidermis 6 zu bilden. Eine Anzahl von anderen 3-D-Modelle wurden entwickelt, um die ex vivo Vermehrung von primären Zellen 7,8 erlauben.
Die entscheidende Rolle der Mikroumgebung der Zellverhalten wurde elegant in einer Studie, in Brustepithelzellen gebildet "inside-out", wenn Acini in Kollagen kultivierten I Matrix, verglichen mit dem vollständig polarisiert Acini, die in Matrigel gebildet wurden demonstriert. Dieser Verlust der korrekten Morphologie wurde rückgängig gemacht, wenn Laminin-produzierenden Myoepithelzellen wurden den Kulturen Kollagen I 9 aufgenommen. Darüber hinaus ist die richtige Mikroumgebung für die genaue erforderlichGenotyp Manifestation. In einer Schale gezüchtet, MCF7-Brustkrebszellen mit einem Zell-Zell-Adhäsionsmolekül CEACAM1 transfiziert verhalten sich genau die gleiche wie die nicht-transfizierten CEACAM negativen Zellen. Wenn jedoch in Matrigel kultiviert, in Kontakt mit ECM, Wildtyp MCF7 Form tumorartige Strukturen, während MCF7 Zellen mit CEACAM1 transfiziert wieder zu einem normalen Phänotyp und Form Acini mit Hohl Lumena, wie mit nicht-malignen Brustepithel 10 eingerichtet. Ebenso Sperr β1-Integrin in Brustkrebszellen nicht deren Verhalten unter Standardkulturbedingungen zu ändern, aber der gleiche Versuch in 3-D-Kulturen durchgeführt zeigt, dass die Blockierung β1-Integrin kehrt malignen Zellen zu einem normalen Phänotyp 11. Daher wird das Gewebe-Mikroumgebung nicht nur erforderlich, um die Lebensfähigkeit der Zellen aufrecht zu erhalten, sondern auch um die richtige Zellfunktion beizubehalten.
Neben der Bereitstellung eines Systems, wo das Zellverhalten unter physiologischen Zustand untersucht werdens, funktionieren 3-D-Kulturen als robustes und zuverlässiges Medium für die präklinische Testung neuer Therapeutika 8,12,13. Kultivieren von Zellen in 3-D ermöglicht Screening von Verbindungen unter den experimentellen Bedingungen der Umwelt-vermittelte Resistenz-14, wo der Beitrag der Zell-Zell-und Zell-ECM-Adhäsion beurteilt werden konnte. Darüber hinaus können Off-Target-Toxizität neuer Verbindungen, die durch die mehrfache zellulären Kompartimenten verschiedener Gewebe festgestellt werden. Solche Bildschirme können schneller durchgeführt werden und sind kostengünstiger als vergleichbare Studien in vivo 8.
Hier präsentieren wir ein Setup von einem 3-D-Modell des rekonstruierten Knochenmark (RBM), wo normalen und malignen Knochenmark (BM)-Zellen vermehren ex vivo in einem System eng imitiert die Mikroumgebung des menschlichen BM. Frühere Versuche zur wachsenden primären humanen Zellen BM in 2-D-Kulturen, flüssigen oder haft Co-Kulturen mit verschiedenen Komponenten des BM StromaOder 3-D, halbfesten Agarkulturen haben mit beschränktem Erfolg aufgrund ihrer Unfähigkeit, die Zellen mit den Komponenten der Gewebemikroumgebung liefern 15-18 erfüllt. In diesen Systemen hatte BM primären Zellen schlechte Rentabilität und nicht zu vermehren ex vivo. Ein anderes System, wo menschliche BM Vorläuferzellen in Sphäroid-Co-Kulturen mit BM Stromazellen gewachsen ist ein 3-D-System, wo hämatopoetischen Stammzelllebensfähigkeit und Proliferation wurde für mindestens 96 Stunden 19 getragen. Obwohl sehr nützlich für das Verständnis der hämatopoetischen Vorläufer Biologie, dieses System nicht getreu rekapitulieren die Mikroumgebung des BM aufgrund der Abwesenheit von ECM-Komponenten, also die Begrenzung ihrer Nützlichkeit. Die hier beschriebene rBM Modell präsentiert ein umfassendes System, wo beide zellulären und extrazellulären Kompartimenten des menschlichen BM werden in vitro rekonstruiert. Wir zeigen, dass rBM Kulturen ex vivo Wachstum von normalen menschlichen BM-Zellen unterstützen, wie wirll als Zellen von Patienten mit verschiedenen hämatologischen Störungen isoliert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die rBM Modell bietet ein umfassendes System, in dem zellulären Zusammensetzung des BM wird ex vivo für bis zu 30 Tage gehalten. BM-Zellen in rBM Selbst Schichtung nach ihrer Funktion eng imitiert die BM-Architektur in vivo gefunden gewachsen. Außerdem ist das erste System, das für die Expansion des multiplen Myeloms Klon 8 ermöglicht. Die wichtigsten Schritte für die Gewährleistung der robuste Wachstum der BM-Zellen und den Gesamterfolg der Kultur sind: 1), um eine gesunde Population…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health, National Cancer Institute (1R21CA141039), BD Biosciences Research Grant Award der American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG # 58-006-53), an die Purdue University Center for Cancer finanziert Forschung, und die kanadischen Institutes of Health Research und dem Alberta Cancer Research Initiatives Vorstand Programm. MP wurde von der National Institutes of Health, National Cancer Institute, Cancer Prevention Internship Program unterstützt (R25CA128770; PI: D. Teegarden) durch die Onkologische Sciences Center und dem Discovery-Learning Research Center an der Purdue University, verabreicht.
Materials
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| Vectashield mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
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