Single-plantas, estéreis Microcosmos para a nodulação e crescimento da planta da leguminosa<em> Medicago truncatula</em> Com o rizóbio Symbiont<em> Sinorhizobium meliloti</em

Summary

Crescimento de plantas truncatula Medicago em simbiose com as bactérias fixadoras de nitrogênio meliloti Sinorhizobium em microcosmos, estéreis individuais feitas a partir de placas de laboratório padrão permite o exame freqüente de sistemas de raízes e nódulos, sem comprometer a esterilidade. As plantas podem ser mantidos em câmaras de crescimento para estes até 9 semanas.

Abstract

Bactérias simbióticas, rizóbios formar nódulos fixadores de nitrogênio nas raízes das plantas leguminosas hospedeiras compatíveis. Um dos sistemas modelo mais bem desenvolvidos para o estudo dessas interações é a planta Medicago truncatula cv. Jemalong A17 eo rizóbio bactéria Sinorhizobium meliloti 1021. Imagem repetida de raízes das plantas e de pontuação de fenótipos simbióticas requer métodos que são não-destrutivas para plantas ou bactérias. Os fenótipos simbióticas de algumas plantas e bactérias mutantes se tornam aparentes após períodos relativamente curtos de crescimento, e não necessitam de observação a longo prazo da interacção hospedeiro / simbionte. No entanto, diferenças sutis na eficiência e nódulo senescência fenótipos simbióticas que não são aparentes nos primeiros estágios do processo de nodulação exigem períodos de crescimento relativamente longo antes que eles possam ser marcado. Vários métodos têm sido desenvolvidos para o crescimento a longo prazo e observação deste par host / simbionte.No entanto, muitos destes métodos requerem rega repetidas, o que aumenta a possibilidade de contaminação por outros microrganismos. Outros métodos requerem um espaço relativamente grande para o crescimento de um grande número de plantas. O método descrito aqui, o crescimento simbiótica de M. truncatula / S. meliloti em estéreis, microcosmos uma única planta, tem várias vantagens. Plantas nestes microcosmos tem humidade e nutrientes suficientes para assegurar que a rega não é necessária para até 9 semanas, impedindo a contaminação cruzada durante a rega. Isso permite que os fenótipos de ser quantificado, que pode ser desperdiçada em sistemas de crescimento de curto prazo, tais como atrasos sutis no desenvolvimento de nódulos e nódulo senescência precoce. Além disso, as raízes e nódulos no microcosmos são facilmente visualizado através da tampa da placa, de modo que se-enraizamento das plantas por observação não é necessária.

Introduction

A interação entre a planta hospedeira leguminosa Medicago truncatula A17 ea bactéria rizóbio Sinorhizobium meliloti 1021 é um dos sistemas modelo mais tratável para o estudo do desenvolvimento de nódulos de raiz e simbiose de fixação de nitrogênio. Os genomas de ambos os parceiros simbióticas foram seqüenciados ^1,2 e ambos planta e bactéria são passíveis de manipulação genética ^3,4. Análise dos fenótipos de ambas plantas e bactérias mutantes requer a capacidade de observar as fases de desenvolvimento de nódulos e para quantificar a produtividade simbiótica com o tempo. Aqui nós descrevemos um método para a observação do desenvolvimento de nódulos de raiz de M. truncatula cv. Jemalong A17 inoculados com S. meliloti 1021 dentro de microcosmos individuais feitas a partir de padrão, rodada 100 mm de diâmetro, 15 milímetros placas de laboratório profundas (Figura 1A). O tiro é exposta e cresce através de um portal dentada no lado da placa (Figures 1B, 1C e 1E). Raízes estão contidos dentro dos microcosmos e mantida estéril, ao mesmo tempo permitindo a observação através da tampa da placa (Figura 1D). Uma vez que o rebento é acessível, o seu crescimento não é limitado e pode ser medida em intervalos periódicos, sem comprometer a esterilidade da raiz. O método de criação de microcosmos entalhado de placa foi desenvolvida originalmente por Leigh, et ​​al. ⁵ para o cultivo de plantas de luzerna, mas não foi amplamente adoptada a despeito das suas muitas vantagens sobre os outros métodos. Uma variação deste método foi também desenvolvido para a análise da interacção entre as raízes das plantas e micorrizas ^6. Temos agora adaptado e optimizado desse método para o crescimento de M. plantas truncatula. As vantagens deste protocolo mais mais frequentemente utilizados métodos estão descritos abaixo.

Existem vários métodos que estão atualmente em uso largo para estudos nodulação de M. truncatula inoculada com S. meliloti ^7. O método mais vulgarmente utilizado para a preparação em larga escala de raízes noduladas é crescimento em caixões aeroponia ^7. Neste método, as plantas são suspensas sobre um recipiente grande e raízes são arejadas com uma mistura de S. meliloti e solução nutriente ^7. Este método é prático se apenas um genótipo de S. meliloti é para ser testado. Uma vez que ele requer aerossolização de concentrações elevadas de bactérias, existe uma alta probabilidade de contaminação cruzada entre os caixões inoculados com diferentes estirpes bacterianas. Outro método que é frequentemente utilizado para preparar grandes quantidades de plantas inoculadas é o crescimento em banheiras ou vasos de perlita, vermiculita, areia ou argila calcinada que são infundidos com solução nutritiva e inoculado com S. meliloti ^7. Este método requer o uso de banheiras ou vasos abertos, e exige rega e reposição da solução nutritiva. Outra desvantagem dos vasos é que as plantasdeve ser removido a partir desta matriz de partículas, para exame das raízes e nódulos. Outra desvantagem deste método é que uma grande área de espaço da incubadora é necessária quando muitos S. diferente genótipos meliloti são para ser comparado, por um recipiente separado devem ser utilizados para cada genótipo bacteriano. O "jar Leonard" é uma variação deste método ^8,9. Um frasco de Leonard é composto por dois vasos esterilizados empilhadas uma em cima da outra e ligadas por uma mecha. O meio de crescimento é colocado no recipiente inferior e puxado através do pavio por acção capilar dentro de uma matriz de crescimento de perlite, vermiculite, areia ou argila calcinada no recipiente superior. A plântula (s) são colocados na matriz de crescimento e inoculadas com S. meliloti. Este método não necessita de rega, mas o exame das raízes e nódulos requer que a plântula ser removido da matriz de crescimento de partículas.

Existem vários métodos que permitem a análise simples de roots. Uma delas é a transparência "bolsa de crescimento" de plástico ^7. Uma desvantagem deste método é que a rega frequente é necessário uma vez que apenas ≤ 10 ml de meio líquido é óptima para o crescimento de M. truncatula em bolsas ^7. Experimentos bolsa também são normalmente limitados a ~ 2 semanas ^7, devido a avaria da torcida papel dentro da bolsa. Dois outros métodos que são vulgarmente usados ​​são semelhantes para o nosso método em que as plantas são cultivadas em agar e as raízes são visíveis, mas estes métodos também apresentam desvantagens que o nosso procedimento evita. Nestes métodos, as plantas estão completamente contidos 24,5 centímetros x 24,5 cm placas de agar seladas em torno da parte superior com fita cirúrgica poroso ou cultivadas em tubos de agar inclinado tapados por meio de tampões de algodão ou de tampas de plástico ^7. Ambos estes métodos permitem um fácil exame das raízes e pode ser mantido estéril. No entanto, os tubos de ágar inclinado são normalmente cultivadas com apenas 20 ml de ágar média ⁷ e requerem irrigação e de nutrientes addition para crescimento a longo prazo de plantas. Plantas cultivadas dentro dos 24,5 centímetros x 24,5 centímetros de ágar microcosmos placa tem umidade e nutrientes para o crescimento de longo prazo suficiente, mas o tiro crescendo rapidamente torna-se restrita dentro do microcosmo placa fechado e gás etileno podem acumular-se inibir a nodulação ^7. No processo descrito aqui, o tiro é exposta e cresce livremente fora do microcosmos contendo ~ 70 mL de meios de comunicação, permitindo que o crescimento a longo prazo.

O processo descrito aqui pode ser útil não só para o estudo de nodulação de plantas leguminosas, mas também para o estudo de fenótipos raízes de outras plantas, de tamanho médio. A diferença entre estes microcosmos e uma planta tradicional policarbonato frasco de cultura de tecidos é que as raízes em microcosmos placa descritos aqui crescer sobre a superfície vertical do agar em vez de para baixo numa camada de agar horizontal na parte inferior do frasco. Isto permite que a raiz para ser levantada da superfície de agar com um mínimo dAmage de pêlos radiculares e adesão mínima de agar à superfície radicular, o que facilita a análise dos pêlos radiculares por microscopia.

Protocol

Realizando os passos 1, 2, 4, 6 e numa câmara de fluxo laminar estéril, é recomendado. 1. Preparação de M. truncatula A17 Mudas Nota: M. truncatula A17 sementes utilizadas nestes estudos são produzidos sob condições de estufa refrigerado a ~ 22 ° C, ou em uma sala de crescimento das plantas mantidas a 22-26 ° C com ~ 150-400 mmol / m -2 s -1 luz. Preparar placas de germinação de sementes: use 100 mil?…

Representative Results

A preparação e inoculação desses microcosmos placa é relativamente simples em comparação com a maioria dos outros métodos descritos na introdução. O uso desses microcosmos também permite o crescimento das plantas prolongada (até 9 semanas) sem rega ou a suplementação de nutrientes, manutenção da esterilidade de raiz, tanto fácil exame de raízes e proteção das raízes da luz, o crescimento sem restrições da parte aérea, de fácil acesso para a parte aérea para medição do comprimento, e a remoç?…

Discussion

Há várias etapas do protocolo que são críticos para o sucesso: 1) A necessidade do uso de purificada, planta de célula de cultura testados agar não pode ser subestimada. Este não é crítica para plântulas de alfafa, mas que é crucial para o crescimento de M. truncatula A17. 2) É importante para germinar sobre placas de agar de mudas verticais como descrito no Passo 1. A técnica amplamente utilizada de germinação de mudas em uma superfície horizontal invertida em uma placa de 15 milímetros de pro…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Agar purified, plant cell culture-tested	Sigma	A7921