根粒とマメ科植物の成長のための単一の植物、滅菌マイクロコズム<em>ウマゴヤシtruncatula</em>根粒共生と<em>シノリゾビウム根粒</em
Summary
標準的な実験プレートから作られた個々の滅菌マイクロコズムにおける窒素固定細菌シノリゾビウム根粒との共生におけるウマゴヤシtruncatulaの植物の成長は、無菌性を損なうことなく、根系や結節の頻繁な検査を可能にします。植物は、最大9週間、これらの成長チャンバー内に維持することができる。
Abstract
根粒菌は、互換性のあるホストマメ科植物の根に共生窒素固定根粒を形成している。これらの相互作用を研究するための最もよく発達したモデル系の一つは、 ウマゴヤシの履歴書をtruncatula植物です。 Jemalong A17と根粒細菌シノリゾビウムは 1021 メリロティ 。植物の根と共生の表現型のスコアリングを繰り返しイメージングは、植物や細菌のいずれかに非破壊的な方法を必要とします。いくつかの植物や細菌の突然変異体の共生表現型は、成長の比較的短い期間の後に明らかになると、ホスト/共生相互作用の長期観測を必要としません。彼らが得点する前にしかし、根粒形成過程の初期段階で明らかにならないの共生効率と結節老化の表現型の微妙な違いは、比較的長い成長期間が必要。いくつかの方法がこのホスト/共生対の長期成長および観察のために開発されている。しかしながら、これらの方法の多くは、他の微生物による汚染の可能性を増大させる繰り返し散水を必要とする。他の方法は、植物の多数の成長のために比較的大きなスペースを必要とする。ここで説明する方法、Mの共生成長truncatula / S滅菌された単一の植物マイクロコズムにおける根粒は 、いくつかの利点があります。これらのマイクロコズム中の植物はその水やりは水やりの際に交差汚染を防ぐ、最大9週間のために必要されていないことを確認するのに十分な水分と栄養を持っている。これは表現型は、結節の開発と早期結節老化の微妙な遅延などの短期的な成長システムに見逃される可能性のある定量化することができます。必要とされていないアップ発根観察のための植物のようにも、小宇宙をルーツと結節が容易に、プレートのふたを通して見ている。
Introduction
マメ科宿主植物ウマゴヤシtruncatula A17とシノリゾビウムは 1021 メリロティ根粒細菌との相互作用は、根粒の発達と窒素固定共生の研究のための最も扱いやすいモデル系の一つである。両方の共生パートナーのゲノムは、1,2を配列決定されており、プラントおよび細菌の両方が遺伝子操作3,4に適している。植物および細菌の変異株の両方の表現型の解析は、根粒の発達の段階を観察し、時間の経過とともに共生の生産性を定量化する能力を必要とします。ここでは、M.の根粒の発達を観察するための方法を記載履歴書をtruncatula。 S.を接種Jemalong A17標準、ラウンド直径100mm、15ミリメートル、深実験室プレート（ 図1A）から作られた個々の小宇宙内メリロティ 1021。シュートは、プレートの側面にある切り欠きのポータル（Figurを介して公開し、成長しているエス1B、1C、および1E）。根は小宇宙の中に含まれているとプレート（ 図1D）の蓋による観察を可能にしながら、無菌保持されます。シュートがアクセス可能であるので、その成長が制約されるものではなく、ルートの無菌性を損なうことなく、定期的に測定することができる。ノッチプレートマイクロコズムを作成する方法は、もともとアルファルファ植物を成長させるためのリーら 5によって開発されたが、それは広く、他の方法に比べて多くの利点にもかかわらず、採用されなかった。この方法のバリエーションは、植物の根と菌根6の間の相互作用を分析するために開発された。我々は今、Mの増殖に適合し、この方法を最適化していますtruncatula工場 。より一般的に使用される方法に勝るこのプロトコルの利点は、以下に説明する。
Mの根粒形成の研究のために現在広く用いられているいくつかの方法があります。 truncatula inocuSでlated メリロティ 7。節のある根の大規模調製のために最も一般的に使用される方法は、aeroponicケーソン7の成長である。この方法では、植物は、大血管上に懸架され、根はS.の混合物で通気されている根粒と栄養溶液7。この方法は現実的であるかのSの唯一の遺伝子型根粒は、テストされる。それは細菌の高濃度のエアロゾル化を必要とするため、異なる細菌株を接種したケーソンの間の交差汚染の可能性が高い。多くの場合、接種した植物を大量に調製するために使用される別の方法は、浴槽またはパーライト、バーミキュライト、砂または栄養溶液を注入し、S.を接種された焼成粘土の鉢で成長であるメリロティ 7。このメソッドは、開いている桶やポットの使用を必要とし、栄養溶液の水やりや補充が必要です。ポットの別の欠点は、植物のことである根や結節の検査のために、この粒子状マトリックスから削除する必要があります。この方法の別の欠点は、ときに、多くの異なるS.インキュベーター空間の大きな領域が必要とされることである別個の鍋は、各細菌の遺伝子型のために使用しなければならないので、 メリロティ遺伝子型は、比較される。 「レナードジャー」は、この方法で8,9のバリエーションです。レナードジャーは、他の上に1を積層して芯で接続された2つの滅菌の容器で構成されている。増殖培地を下部容器に入れ、パーライト、バーミキュライト、砂、上部容器中の焼成粘土の成長マトリックス中に毛管作用によって芯を通って引き込まれる。苗（単数または複数）は、成長マトリックス中に入れ、S.を接種するメリロティ 。この方法は、水やりは必要ありませんが、根や結節の検査では、苗が粒子状の成長マトリックスから削除されている必要があります。
カンガルーの簡単な検査を可能にするか、いくつかの方法がありますTS。これらの一つは、透明なプラスチックの「成長パウチ」7である。この方法の欠点は、≤10ミリリットルの液体媒体はM.を成長させるために最適であるので、頻繁な散水が必要とされることである小袋7 truncatula。ポーチ実験はまた、通常のため、ポーチ内の紙芯の内訳を、〜2週間7に限定されている。一般的に使用される2つの他の方法は、植物を寒天上で増殖させ、根が見えるされていることに我々の手法と同様であるが、これらの方法はまた、我々の手順が回避される欠点を有する。これらの方法では、植物は完全に24.5センチメートル多孔サージカルテープでトップの周りに密封された、または綿のプラグまたはプラスチック製のキャップ7で栓を寒天スラント試験管で栽培X 24.5センチメートル寒天プレート内に含まれています。これらの方法はいずれも、根の容易な検査を可能にし、無菌に保つことができる。しかし、寒天斜面管は通常、媒体7寒天のみ20ミリリットルで増殖させ、水やりと栄養A必要植物の長期的な成長のためにddition。 24.5センチメートルX 24.5センチメートル内寒天平板マイクロコズムを成長した植物は、長期的な成長のために十分な水分と栄養を持っていますが、根粒7を阻害する構築することができ、成長のシュートを速やかに囲まれたプレート縮図とエチレンガス内に拘束になる。ここで説明する手順では、シュートを露出させ、長期的な成長を可能にするメディアの〜70ミリリットルが含まれている小宇宙の外に自由に成長する。
ここで説明する手順は、マメ科植物の根粒形成の研究のためだけでなく、他の中型植物の根の表現型の研究のためだけでなく、有用であり得る。これらの小宇宙と伝統的なポリカーボネートの植物組織培養瓶の違いは、ここで説明するプレートマイクロコズムにおける根がダウンジャーの底に寒天の水平層に寒天の垂直面上に成長ではなく、ということです。これは、ルートは、最小のdの寒天表面から持ち上げられることを可能にする根毛や顕微鏡によって根毛の検査を容易に根表面に寒天の最小付着amage。
Protocol
Representative Results
Discussion
成功のために不可欠なプロトコルのいくつかのステップがあります：1）精製された、植物細胞培養を使用する必要は寒天を強調しすぎることはできませんテストされています。これはアルファルファの苗のために重要ではないが、それはMの成長のために重要であるtruncatula A17。 2）ステップ1に記載したように垂直寒天プレート上に実生を発芽することが重要である。苗の根がま…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、原稿の批判的検討のためにブライアン·K·ウォッシュバーンに感謝KMJに20582 – この作品は、米国農務省国立食糧農業研究所、農業·食品産業技術総合研究イニシアティブ助成金2010から65108によって賄われていた。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agar purified, plant cell culture-tested | Sigma | A7921 |
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