유괴와 콩과 식물의 성장을위한 단일 공장, 무균 소우주<em> 개자리 truncatula</em> Rhizobial 공생과<em> Sinorhizobium meliloti</em
Summary
표준 실험실 접시에서 만든 개별 멸균 소우주의 질소 고정 박테리아 Sinorhizobium meliloti과의 공생에 개자리의 truncatula 식물의 성장 저하 불임없이 루트 시스템과 결절의 자주 검사를 허용합니다. 식물은 최대 9 주 동안 이러한 성장 챔버에서 유지 될 수있다.
Abstract
Rhizobial 박테리아는 호환 호스트 콩과 식물의 뿌리에 공생 질소 고정 결절을 형성한다. 이러한 상호 작용을 연구하기위한 가장 잘 개발 된 모델 시스템 중 하나는 개자리는 이력서를 truncatula 식물입니다. Jemalong A17와 rhizobial 박테리아 Sinorhizobium는 1021 meliloti. 식물 뿌리와 공생 표현형의 득점 반복 영상은 식물이나 박테리아 중 하나에 비 파괴적 방법이 필요합니다. 일부 식물 및 박테리아 변이주의 표현형 공생 성장의 상대적으로 짧은 기간 후에 명백하고, 호스트 / 공생 상호 작용의 장기 관측을 필요로하지 않는다. 그들이 득점하기 전에 그러나, 유괴 과정의 초기 단계에서 식별 할 수없는 공생의 효율성과 결절 노화 표현형에 미묘한 차이가 비교적 긴 성장 기간을 필요로합니다. 몇몇 방법들은 장기적인 성장 및이 호스트 / 공생 쌍의 관측을 위해 개발되었다.그러나, 이러한 방법의 대부분은 다른 미생물에 의한 오염의 가능성을 증가 반복 물을 필요로합니다. 다른 방법은 식물의 많은 수의 성장을 위해 상대적으로 큰 공간이 필요합니다. 상기 방법은 여기에서 M. 공생의 성장을 설명 truncatula / S. 살균, 단일 식물 소우주에 meliloti은 몇 가지 장점이 있습니다. 이 소우주에있는 식물은 물이 물을 때 교차 오염을 방지, 최대 9 주 동안 필요하지 않습니다 보장하기 위해 충분한 수분과 영양분이 있습니다. 이 표현형는 결절의 개발 및 초기 결절 노화의 미묘한 지연 등의 단기 성장 시스템에서 누락 될 수 있습니다 것을 정량화 할 수 있습니다. 업 응원 관찰 식물이 필요하지 않도록 또한, 소우주의 뿌리 결절은 쉽게 플레이트 뚜껑을 통해 볼 수 있습니다.
Introduction
콩과 식물 기주 식물 개자리의 truncatula A17와 Sinorhizobium는 1021 meliloti rhizobial 박테리아 사이의 상호 작용은 루트 결절 개발 및 질소 고정 공생의 연구를위한 가장 다루기 쉬운 모델 시스템 중 하나입니다. 모두 공생 파트너의 게놈은 1,2 염기 서열을 한 식물과 박테리아 모두 유전자 조작 3,4 의무가 있습니다. 식물과 박테리아의 돌연변이 모두의 표현형 분석 결절 개발의 단계를 관찰하고 시간이 지남에 따라 공생 생산성을 정량화 할 수있는 능력을 필요로한다. 여기에서 우리는 M.의 루트 결절 개발을 관찰하는 방법을 설명합니다 이력서를 truncatula. S. 접종 Jemalong A17 표준, 둥근 직경 100mm, 15mm 깊은 실험실 접시 (그림 1A)에서 만든 각각의 소우주 내 meliloti 1021. 촬영은 접시의 측면에있는 노치 포털 (를 통해 노출 및 성장한다 FigurES 1B, 1C 및 1E). 뿌리는 소우주에 포함 된 플레이트 (그림 1D)의 뚜껑을 통해 관찰을 허용하면서, 멸균 보관됩니다. 촬영에 액세스하기 때문에, 그 성장이 제한되지 않고 루트의 무균 저하없이 주기적으로 측정 될 수있다. 노치 플레이트 소우주를 만드는 방법은 원래 알팔파 식물 성장을위한 리, 등. (5)에 의해 개발 된,하지만 널리 다른 방법에 비해 수많은 장점에도 불구하고 채택되지 않았다. 이 방법의 변형은 식물 뿌리와 mycorrhizae (6) 사이의 상호 작용의 분석을 위해 개발되었다. 우리는 지금 M.의 성장에 적응이 방법을 최적화 한 truncatula 식물. 더 일반적으로 사용되는 방법을 통해이 프로토콜의 장점은 다음과 같습니다.
M.의 유괴 연구에 대한 폭 넓은 현재 사용중인 방법은 여러 가지가 있습니다 truncatula inocuS.와 lated meliloti 7. 마디가있는 뿌리의 대규모 준비를 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법은 aeroponic 케이슨 7의 성장입니다. 이 방법에서는, 식물은 큰 용기에 일시 중단 뿌리는 S.의 혼합물로 폭기된다 meliloti 및 영양 솔루션 7. 이 방법은 실제적인 경우 S. 단 하나의 유전자형 meliloti 테스트 할 수 있습니다. 이 세균의 높은 농도의 에어로졸 화를 필요로하기 때문에, 서로 다른 박테리아 균주를 접종 케이슨 간의 교차 오염의 가능성이 높다. 종종 접종 식물의 대량 제조에 사용되는 또 다른 방법은 욕조 또는 펄라이트, 버미큘라이트, 모래 또는 양액 주입 및 S. 접종되어 소성 점토 냄비 성장이다 meliloti 7. 이 방법은 오픈 욕조 또는 포트의 사용을 필요로하고, 양액의 급수 및 보충을 필요로한다. 냄비의 또 다른 단점은 식물뿌리와 결절의 진단이 미립자 행렬에서 제거해야합니다. 이 방법의 또 다른 단점은 다양한 S. 때 인큐베이터 공간의 넓은 면적이 요구된다는 것이다 meliloti 유전자형은 별도 냄비 각 세균의 유전자형을 위해 사용되어야하기 때문에, 비교해야한다. "레너드 항아리는"이 방법 8,9의 변형입니다. 레너드 항아리는 하나가 다른 하나의 위에 스택 및 심지에 의해 연결된 두 개의 멸균 용기로 구성되어있다. 성장 배지는 하부 용기에 넣고, 펄라이트, 버미큘라이트, 모래 또는 상측 용기에서 하소 점토의 성장 매트릭스에 모세관 현상에 의해 심지를 통해 그려진다. 모종 (들)은 성장 행렬에 넣고 S.로 접종 meliloti. 이 방법은 물을 필요로하지 않지만, 뿌리와 결절의 검사는 모종은 입자 성장 매트릭스에서 제거해야합니다.
타나로 오의 쉬운 시험을 허용 않는 방법은 여러 가지가 있습니다TS. 이 중 하나는 투명 플라스틱 "성장 주머니"7입니다. 이 방법의 단점은 자주 물이 액체 배지가 M. 성장에 최적입니다 만 ≤ 10 ㎖ 때문에 필요한 것입니다 파우치 7 truncatula. 주머니 실험은 일반적으로 인해 주머니 안에 종이 심지의 고장, 2 주 ~ 7로 제한됩니다. 일반적으로 사용되는 두 가지 다른 방법은 식물이 한천에서 성장하고 뿌리를 볼 수 있습니다 것을 우리의 방법과 유사하지만, 이러한 방법은 우리의 절차는 피할 단점이 있습니다. 이러한 방법으로, 식물이 완전히 24.5 cm 다공성 외과 테이프를 맨 주위를 밀봉하거나면 마개 또는 플라스틱 캡 7 마개 한천 경사 관에서 재배 X 24.5 cm 한천 플레이트에 포함됩니다. 두 방법 모두 뿌리 쉽게 시험을 허용하고 멸균 유지 될 수있다. 그러나, 한천 기울기 튜브는 일반적으로 중간 7 한천 20 ㎖로 성장하고 물과 영양분이 필요합니다식물의 장기 성장 ddition. 24.5 cm 내에서 재배 식물은 24.5 cm 한천 플레이트 소우주 충분한 수분과 장기 성장을위한 영양분을 가지고 있지만, 성장 촬영이 빨리 동봉 판 소우주와 에틸렌 가스가 유괴 7을 억제 구축 할 수 있습니다 내에서 제한된다 x. 여기에 기술 된 절차에서, 촬영은 노출 및 장기 성장을 가능 매체 ~ 70 ㎖에 포함 축도 외측 자유롭게 성장한다.
여기에서 설명하는 절차는 콩과 식물의 유괴의 연구뿐만 아니라 다른 중간 크기의 식물의 뿌리 표현형의 연구뿐만 아니라 유용 할 수 있습니다. 이 소우주와 기존의 폴리 카보네이트 공장 조직 문화 단지의 차이는 여기에 설명 된 판의 소우주에 뿌리가 아래로 항아리의 맨 아래에있는 한천의 수평 층으로 한천의 수직 표면에 성장이 아닌 것입니다. 이 루트는 최소한의 개발과 한천 표면의 오프 해제 할 수 있습니다루트 머리와 현미경으로 루트 머리카락의 시험을 용이하게 뿌리 표면에 한천의 최소한의 접착에 amage.
Protocol
Representative Results
Discussion
성공을위한 중요한 프로토콜의 몇 가지 단계가 있습니다 : 1) 정제, 식물 세포 배양을 사용의 필요성은 한천은 아무리 강조해도 지나치지 않습니다 테스트. 이것은 알팔파 모종 중요하지이지만, M.의 성장에 중요 truncatula A17. 2) 1 단계에서 설명 된대로 수직 한천 플레이트에 모종을 발아하는 것이 중요합니다. 모종의 뿌리가 바로 너무 짧은 및 / 또는 일 것이다 때문에 15mm 깊이 판 (…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고의 중요한 검토를 위해 브라이언 K. 워시번 감사 KMJ에 20582 -이 작품은 USDA 국립 식량 농업 연구소, 농업 및 식품 연구 이니셔티브 부여 2010-65108에 의해 투자되었다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agar purified, plant cell culture-tested | Sigma | A7921 |
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