Single-plant, Steriel Microcosmi voor nodulatie en groei van de peulvrucht installatie<em> Medicago truncatula</em> Met de stikstofbindende Symbiont<em> Sinorhizobium meliloti</em

Summary

Groei van Medicago truncatula planten in symbiose met de stikstofbindende bacteriën Sinorhizobium meliloti in individuele, steriele microkosmossen gemaakt van standaard laboratorium platen maakt veelvuldig onderzoek van het wortelstelsel en knobbeltjes, zonder afbreuk te doen aan de steriliteit. Planten kunnen in deze groeikamers worden gehandhaafd tot 9 weken.

Abstract

Stikstofbindende bacteriën vormen symbiotische, stikstofbindende knobbeltjes op de wortels van compatibele host vlinderbloemige planten. Een van de meest goed ontwikkelde modelsystemen voor de studie van deze interacties is de plant Medicago truncatula cv. Jemalong A17 en de stikstofbindende bacterie Sinorhizobium meliloti 1021. Herhaalde beeldvorming van plantenwortels en scoren van symbiotische fenotypes vereist methoden die niet-destructief om ofwel planten of bacteriën. De symbiotische fenotypes van sommige planten en bacteriële mutanten duidelijk worden na relatief korte perioden van groei, en geen langdurige observatie van de gastheer / symbiont interactie vereisen. Echter, subtiele verschillen in symbiotische efficiëntie en knobbeltje veroudering fenotypes die niet zichtbaar zijn in de vroege stadia van de nodulatie proces vereisen relatief lange periodes groei voordat ze kunnen worden gescoord. Verscheidene werkwijzen zijn ontwikkeld voor groei en observatie van de gastheer / symbiont paar lange termijn.Echter, veel van deze methoden vereisen herhaalde water, die de mogelijkheid van verontreiniging met andere microben vergroot. Andere methoden vereisen een relatief grote ruimte voor de groei van grote aantallen planten. De beschreven methode hier, symbiotische groei van M. truncatula / S. meliloti in steriele, single-fabriek microkosmos, heeft verschillende voordelen. Planten in deze batches voldoende vocht en voedingsstoffen zodat water niet nodig tot 9 weken, voorkomen kruisbesmetting tijdens drenken. Hierdoor kunnen fenotypes te worden gekwantificeerd die kunnen worden gemist op korte termijn groei systemen, zoals subtiele vertragingen in knobbeltje ontwikkeling en vroege knobbeltje veroudering. Ook zijn de wortels en knobbeltjes in de microcosmos gemakkelijk gezien door de plaat deksel, zodat actuele beworteling van de planten waarneming is niet vereist.

Introduction

De interactie tussen de peulvruchten waardplant Medicago truncatula A17 en de stikstofbindende bacterie Sinorhizobium meliloti 1021 is een van de meest handelbare modelsystemen voor de studie van de wortel nodule ontwikkeling en stikstofbindende symbiose. De genomen van beide symbiotische partners zijn gesequenced ^1,2 en zowel plant als bacterie vatbaar zijn voor genetische manipulatie ^3,4. Analyse van de fenotypen van zowel plantaardige en bacteriële mutanten vereist het vermogen om de stadia van ontwikkeling nodule observeren en de symbiotische productiviteit kwantificeren tijd. Hier beschrijven we een methode voor de waarneming van de wortel knobbel ontwikkeling van M. truncatula cv. Jemalong A17 geënt met S. meliloti 1021 binnen afzonderlijke microkosmos gemaakt van standaard, rond 100 mm diameter, 15 mm diep laboratorium platen (Figuur 1A). De shoot is blootgesteld en groeit door een getande portaal in de zijkant van de plaat (Figures 1B, 1C en 1E). Wortels zijn vervat in de microkosmossen en hield steriele, terwijl waarneming door het deksel van de plaat (figuur 1D). Aangezien de shoot toegankelijk is, is de groei niet beperkt en kan worden gemeten periodiek zonder de steriliteit van de wortel. De methode om getande plaat batches werd oorspronkelijk ontwikkeld door Leigh, et ​​al.. ⁵ voor het kweken alfalfa planten, maar het was niet wijd goedgekeurd ondanks zijn vele voordelen boven andere methoden. Een variant op deze methode werd ontwikkeld voor de analyse van de interactie tussen plantenwortels en mycorrhizae ^6. We hebben nu aangepast en geoptimaliseerd deze methode voor de groei van M. truncatula planten. De voordelen van dit protocol dan meer gebruikelijke methoden worden hieronder beschreven.

Er zijn verschillende methoden die momenteel veel gebruikt voor nodulatie studies van M. truncatula inoculatieberekend met S. meliloti ^7. De meest gebruikte methode voor grootschalige bereiding van bladnodulerende wortels is de groei in luchtteelt caissons ^7. In deze methode worden planten opgehangen over een groot vat en wortels worden belucht met een mengsel van S. meliloti en voedingsoplossing ^7. Deze methode is handig als slechts een genotype van S. meliloti worden uitgetest. Aangezien aërosolvorming van hoge concentraties bacteriën vereist, is er een grote kans op kruisbesmetting tussen caissons geïnoculeerd met verschillende bacteriestammen. Een andere methode die vaak wordt gebruikt om grote hoeveelheden geïnoculeerde planten bereiden is groei in kuipen of potten van perliet, vermiculiet, zand of gecalcineerde klei die zijn doordrenkt met voedingsoplossing en geïnoculeerd met S. meliloti ^7. Deze methode vereist het gebruik van open bakken of potten, en vereist drenken en het bijvullen van de voedingsoplossing. Een ander nadeel van potten is dat plantenmoeten worden verwijderd uit deze deeltjes matrix voor het onderzoek van de wortels en knobbeltjes. Een ander nadeel van deze werkwijze is dat een groot gebied van incubator ruimte nodig wanneer veel verschillende S. meliloti genotypen worden vergeleken, omdat een aparte pot worden gebruikt voor elke bacteriële genotype. De "Leonard jar" is een variant op deze methode ^8,9. Een Leonard pot bestaat uit twee gesteriliseerd vaartuigen gestapeld bovenop elkaar en verbonden door een lont. Groeimedium geplaatst in het onderste vat opgesteld door de lont door capillaire werking in een groeimatrix perliet, vermiculiet, zand of gecalcineerde klei in het bovenste vat. De zaailing (s) in de groei matrix geplaatst en geïnoculeerd met S. meliloti. Deze methode vereist geen water geven, maar onderzoek van wortels en knobbeltjes vereist dat de zaailing van de deeltjes groei matrix worden verwijderd.

Er zijn verschillende methoden die wel toestaan ​​eenvoudig onderzoek van roots. Een daarvan is de doorzichtige plastic "growth etui" ^7. Een nadeel van deze werkwijze is dat vaak water nodig aangezien slechts ≤ 10 ml vloeibaar medium voor optimale groei M. truncatula in zakjes ^7. Pouch experimenten worden ook meestal beperkt tot ~ 2 weken ^7, als gevolg van afbraak van het papier lont in het zakje. Twee andere methoden die algemeen worden gebruikt zijn vergelijkbaar met onze werkwijze dat de planten gekweekt op agar en wortels zichtbaar, maar deze werkwijzen hebben ook nadelen dat onze procedure vermijdt. In deze werkwijzen worden planten geheel opgenomen binnen 24.5 cm x 24.5 cm agarplaten afgedicht rond de bovenkant met poreuze chirurgische tape of gekweekt in-agar schuine buizen afgesloten met prop watten of plastic doppen ^7. Beide methoden maken een eenvoudige onderzoek van wortels en kunnen steriel worden gehouden. Echter, de agarslant buizen meestal gekweekt met slechts 20 ml agar medium ⁷ en vereisen drenken en voedingsstoffen eenddition voor lange termijn groei van planten. Planten binnen de 24,5 cm x 24,5 cm agar plaat microkosmossen voldoende vocht en voedingsstoffen voor de groei op lange termijn, maar de groeiende shoot snel wordt beperkt binnen de bijgevoegde plaat microkosmos en ethyleen gas kan opbouwen remmen nodulatie ^7. In de hier beschreven procedure, wordt de shoot blootgesteld en groeit vrij buiten de microkosmos die ~ bevat 70 ml van de media, waardoor de groei op lange termijn.

De hier beschreven procedure kan niet alleen nuttig zijn voor de studie van nodulatie van vlinderbloemige planten, maar ook voor de studie van wortel fenotypen andere middelgrote planten. Het verschil tussen deze microkosmossen en een traditionele polycarbonaat plantenweefsel cultuur pot is dat wortels in de plaat batches beschreven groeien op het verticale oppervlak van de agar dan naar beneden in een horizontale laag van agar onderaan de pot. Hierdoor kan de wortel worden getild van het agar oppervlak met minimale dAmage naar wortelharen en minimale hechting van agar aan de wortel oppervlak, dat het onderzoek van wortelharen vergemakkelijkt door microscopie.

Protocol

Stappen 1, 2, 4 en 6 in een steriele laminaire stroming kap wordt aanbevolen. 1. Bereiding van M. truncatula A17 Zaailingen Opmerking: M. truncatula A17 zaden die in deze studies worden geproduceerd onder kas condities gekoeld bij ongeveer 22 ° C, of een plantengroei kamer gehandhaafd op 22-26 ° C ~ 150-400 mmol / m -2 s -1 licht. Giet zaadgerminatie platen: Gebruik 100 mm vierkante platen (15 mm diep) en giet …

Representative Results

De bereiding en inoculatie van deze plaat microcosmos is relatief eenvoudig in vergelijking met andere methoden in de inleiding beschreven. Het gebruik van deze microkosmos laat ook langdurig plantengroei (maximaal 9 weken) zonder water of voedingssupplementen, onderhoud van wortel steriliteit, zowel gemakkelijk onderzoek van wortels en de bescherming van de wortels van het licht, groei van de vrije plant scheuten, gemakkelijke toegang tot de shoot voor lengtemeting, en verwijdering van planten uit de batches met minima…

Discussion

Er zijn verschillende stappen van het protocol dat van cruciaal belang voor het succes zijn: 1) De noodzaak van het gebruik van gezuiverd, plantencel-cultuur getest agar kan niet genoeg benadrukt worden. Dit is niet kritisch voor alfalfa zaailingen, maar het is essentieel voor de groei van M. truncatula A17. 2) Het is belangrijk dat zaailingen ontkiemen inzake verticale agarplaten zoals beschreven in stap 1. De veel gebruikte techniek van kiemende zaailingen op een omgekeerde horizontaal oppervlak in een 15 mm …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Agar purified, plant cell culture-tested	Sigma	A7921