Singola pianta, sterili Microcosmi per nodulazione e crescita della pianta delle leguminose<em> Medicago truncatula</em> Con il rhizobial Symbiont<em> Sinorhizobium meliloti</em
Summary
Crescita delle piante truncatula Medicago in simbiosi con i batteri azoto-fissatori meliloti Sinorhizobium nei singoli, microcosmi sterili fatto da lastre di laboratorio standard consente l'esame frequente dei sistemi di radici e noduli senza compromettere la sterilità. Le piante possono essere mantenuti in queste camere di crescita fino a 9 settimane.
Abstract
Batteri rhizobial formano simbiotici, noduli azoto-fissatori sulle radici delle piante leguminose host compatibili. Uno dei sistemi modello più ben sviluppati per lo studio di queste interazioni è la pianta Medicago truncatula cv. Jemalong A17 e la rhizobial batterio Sinorhizobium meliloti 1021. L'imaging ripetuta delle radici delle piante e punteggio della fenotipi simbiotici richiede metodi che non sono distruttive per piante o batteri. I fenotipi simbiotici di alcuni impianti e mutanti batterici si manifestano dopo periodi relativamente brevi di crescita, e non necessitano di osservazione a lungo termine delle interazioni ospite / simbionte. Tuttavia, sottili differenze di efficienza e di nodulo senescenza fenotipi simbiotici che non sono evidenti nelle prime fasi del processo di nodulazione richiedono periodi di crescita relativamente lunghi prima di poter essere segnato. Diversi metodi sono stati sviluppati per la crescita a lungo termine e l'osservazione di questa coppia host / simbionte.Tuttavia, molti di questi metodi richiedono annaffiature ripetuto, che aumenta la possibilità di contaminazione da parte di altri microbi. Altri metodi richiedono uno spazio relativamente grande per la crescita di un gran numero di piante. Il metodo qui descritto, la crescita simbiotica di M. truncatula / S. meliloti in sterili, microcosmi singolo impianto, ha diversi vantaggi. Piante in questi microcosmi sono l'umidità e le sostanze nutrienti sufficienti a garantire che l'irrigazione non è richiesto per un massimo di nove settimane, impedendo la contaminazione incrociata durante l'irrigazione. Questo permette di fenotipi da quantificare che potrebbero essere mancati in sistemi di crescita a breve termine, come i ritardi sottili nello sviluppo del nodulo e all'inizio nodulo senescenza. Inoltre, le radici e noduli nel microcosmo vengono visualizzati facilmente attraverso il coperchio piatto, quindi non è necessario fino radicazione delle piante per l'osservazione.
Introduction
L'interazione tra la pianta ospite legume Medicago truncatula A17 e il batterio rhizobial Sinorhizobium meliloti 1021 è uno dei sistemi modello più trattabili per lo studio di radice sviluppo nodulo e azotofissatrice simbiosi. I genomi di entrambi i partner simbiotici sono stati sequenziati 1,2 e vegetali e batteri sono suscettibili di manipolazione genetica 3,4. Analisi dei fenotipi di vegetali e mutanti batterici richiede la capacità di osservare le fasi di sviluppo del nodulo e per quantificare la produttività simbiotico nel tempo. Qui si descrive un metodo per l'osservazione dello sviluppo radicale nodulo di M. truncatula cv. Jemalong A17 inoculati con S. meliloti 1021 all'interno dei singoli microcosmi fatti dallo standard, rotonda diametro 100 millimetri, 15 millimetri piastre di laboratorio profondi (Figura 1A). La ripresa viene esposto e cresce attraverso un portale dentata sul lato della piastra (Figures 1B, 1C e 1E). Radici sono contenuti all'interno dei microcosmi e mantenuti sterili, mentre permette l'osservazione attraverso il coperchio della piastra (Figura 1D). Poiché il tiro è accessibile, la sua crescita non è vincolato e può essere misurata ad intervalli periodici senza compromettere la sterilità della radice. Il metodo di creazione di microcosmi dentellato-targa è stato originariamente sviluppato da Leigh, et al. 5 per la coltivazione di piante di erba medica, ma non è stato largamente adottato a dispetto dei suoi numerosi vantaggi rispetto ad altri metodi. Una variante di questo metodo è stato sviluppato anche per l'analisi dell'interazione tra le radici delle piante e micorrize 6. Abbiamo ora adattato e ottimizzato questo metodo per la crescita di M. piante truncatula. I vantaggi di questo protocollo oltre più comunemente utilizzati metodi sono descritti di seguito.
Ci sono diversi metodi che sono attualmente in uso largo per gli studi nodulazione di M. truncatula inoculolata con S. meliloti 7. Il metodo più comunemente usato per la preparazione su larga scala di radici nodulated è la crescita in cassoni aeroponic 7. In questo metodo, le piante sono sospese su una grande nave e radici sono aerati con una miscela di S. meliloti e soluzione nutritiva 7. Questo metodo è pratico se solo un genotipo di S. meliloti è da testare. Poiché richiede aerosol di elevate concentrazioni di batteri, c'è un'alta probabilità di contaminazione incrociata tra cassoni inoculati con differenti ceppi batterici. Un altro metodo che viene spesso utilizzato per preparare grandi quantità di piante inoculate è la crescita in tini o in vasi di perlite, vermiculite, sabbia o argilla calcinata che sono infuso con soluzione nutritiva e inoculato con S. meliloti 7. Questo metodo richiede l'utilizzo di vasche aperte o in vasi, e richiede irrigazione e la ricarica della soluzione nutritiva. Un altro svantaggio di pentole è che le piantedeve essere rimosso da questa matrice di particolato per l'esame delle radici e noduli. Un altro inconveniente di questo metodo è che una vasta area di spazio incubatore è necessaria quando molti differenti S. genotipi meliloti devono essere confrontati, perché una pentola a parte deve essere utilizzato per ogni genotipo batterico. Il "vaso Leonard" è una variante di questo metodo di 8,9. Un vaso Leonard è composto di due vasi sterilizzati impilati uno sopra l'altro e collegati da uno stoppino. Terreno di coltura viene inserito nel recipiente inferiore ed aspirata attraverso lo stoppino per capillarità in una matrice di crescita di perlite, vermiculite, sabbia o argilla calcinata nel recipiente superiore. La piantina (s) sono posti nella matrice crescita e inoculato con S. meliloti. Questo metodo non richiede irrigazione, ma l'esame delle radici e noduli richiede che la piantina essere rimosso dalla matrice crescita particolato.
Ci sono diversi metodi che consentono un facile esame della roots. Uno di questi è il transparent "sacchetto di crescita" plastica 7. Uno svantaggio di questo metodo è che l'irrigazione frequente è necessaria poiché solo ≤ 10 ml di terreno liquido è ottimale per la crescita di M. truncatula in sacchetti 7. Esperimenti Pouch sono di solito limitati a ~ 2 settimane 7, grazie alla ripartizione dello stoppino di carta all'interno del sacchetto. Altri due metodi comunemente utilizzati sono simili al nostro metodo dal fatto che le piante sono coltivate su agar e le radici sono visibili, ma questi metodi hanno anche svantaggi che la nostra procedura evita. In questi metodi, le piante sono completamente contenute all'interno di 24,5 centimetri x 24,5 cm piastre di agar sigillate intorno alla parte superiore con del nastro adesivo chirurgico poroso o coltivate in tubi di agar-slant tappate con tappi di cotone o tappi di plastica 7. Entrambi questi metodi consentono un facile esame delle radici e può essere conservato sterile. Tuttavia, i tubi slant agar sono di solito coltivate con solo 20 ml di agar 7 e richiedono di acqua e nutrienti addition per la crescita a lungo termine delle piante. Le piante coltivate entro i 24,5 centimetri x 24,5 centimetri di agar microcosmi piastre hanno umidità e sostanze nutritive per la crescita a lungo termine sufficiente, ma il germoglio che cresce rapidamente diventa vincolati all'interno del microcosmo piastra chiusa e il gas etilene possono accumularsi inibendo nodulazione 7. Nella procedura qui descritta, la ripresa è esposto e cresce liberamente al di fuori del microcosmo che contiene ~ 70 ml di mezzi di comunicazione, permettendo la crescita a lungo termine.
La procedura descritta può essere utile non solo per lo studio di nodulation di piante leguminose, ma anche per lo studio dei fenotipi radici di altre piante di medie dimensioni. La differenza tra questi microcosmi e un tradizionale impianto policarbonato tessuto-cultura vaso è che radici nei microcosmi piastra qui descritti crescono sulla superficie verticale della agar piuttosto che verso il basso in uno strato orizzontale di agar al fondo del vaso. Questo permette la radice da sollevare dalla superficie agar con minima dAmage ai peli radicali e spessore ridotto agar alla superficie della radice, che facilita l'esame dei peli radicali al microscopio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono diversi passaggi del protocollo che sono fondamentali per il successo: 1) La necessità di usare purificato, pianta coltura cellulare testato agar non può essere sottovalutata. Questo non è critica per piantine di erba medica, ma è fondamentale per la crescita di M. truncatula A17. 2) E 'importante germinare piantine su piastre di agar verticali come descritto nella Fase 1. La tecnica ampiamente usata di germinazione piantine su una superficie orizzontale rovesciato in un piatto fondo 15 millimet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dall'Istituto USDA Nazionale di alimentazione e l'agricoltura, agricoltura e alimentazione Research Initiative concessione 2010-65.108 – 20582 a KMJ Ringraziamo Brian K. Washburn per la revisione critica del manoscritto.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agar purified, plant cell culture-tested | Sigma | A7921 |
References
- Galibert, F., et al. The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti. Science. 293, 668-672 (2001).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480, 520-524 (2011).
- Glazebrook, J., Walker, G. C. Genetic techniques in Rhizobium meliloti. Methods Enzymol. 204, 398-418 (1991).
- Cheng, X., Wen, J., Tadege, M., Ratet, P., Mysore, K. S. Reverse genetics in medicago truncatula using Tnt1 insertion mutants. Methods Mol Biol. 678, 179-190 (2011).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 6231-6235 (1985).
- Wong, K. K. Y., Fortin, J. A. A Petri Dish Technique for the Aseptic Synthesis of Ectomycorrhizae. Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne De Botanique. 67, 1713-1716 (1989).
- Barker, D. G., Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W., et al. . The Medicago truncatula handbook. , (2006).
- Leonard, L. T. A Simple Assembly for Use in the Testing of Cultures of Rhizobia. J Bacteriol. 45, 523-527 (1943).
- Trung, B. C., Yoshida, S. Improvement of Leonard jar assembly for screening of effective rhizobium. Soil Sci Plant Nutr. 29, 97-100 (1983).
- Penmetsa, R. V., Cook, D. R. Production and characterization of diverse developmental mutants of Medicago truncatula. Plant Physiol. 123, 1387-1398 (2000).
- Garcia, J., Barker, D. G., Journet, E. P., Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. . The Medicago truncatula handbook. , (2006).
- Vincent, J. M. . A Manual for the Practical Study of the Root-Nodule Bacteria. , (1970).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1982).
- Pladys, D., Vance, C. P. Proteolysis during Development and Senescence of Effective and Plant Gene-Controlled Ineffective Alfalfa Nodules. Plant Physiology. 103, 379-384 (1993).
- Vasse, J., de Billy, F., Truchet, G. Abortion of infection during the Rhizobium meliloti-alfalfa symbiotic interaction is accompanied by a hypersensitive reaction. The Plant J. 4, 555-566 (1993).
- Johnson, L. E. B., Vance, C. P. Histological and Biochemical Comparisons of Plant Induced Ineffective Nodules. Phytopathology. 71, 884 (1981).
- Vance, C. P., Johnson, L. E. B., Hardarson, G. Histological Comparisons of Plant and Rhizobium Induced Ineffective Nodules in Alfalfa. Physiological Plant Pathology. 17, 167 (1980).
- Van de Velde, W., et al. Aging in legume symbiosis. A molecular view on nodule senescence in Medicago truncatula. Plant Physiol. 141, 711-720 (2006).
- Jones, K. M. Increased production of the exopolysaccharide succinoglycan enhances Sinorhizobium meliloti 1021 symbiosis with the host plant Medicago truncatula. J Bacteriol. 194, 4322-4331 (2012).
- Queiroux, C., et al. A comparative genomics screen identifies a Sinorhizobium meliloti 1021 sodM-like gene strongly expressed within host plant nodules. BMC Microbiol. 12, 74 (2012).
