Быстрый и эффективный метод оценки патогенности Ustilago maydis на линиях кукурузы и teosinte
Summary
Описано использование метода инъекций иглы для прививки растений кукурузы и тоозинта биотрофическим патогеном Ustilago maydis. Метод инъекции иглы облегчает контролируемую доставку грибкового патогена между листьями растений, где возбудитель попадает в растение через образование аппресории. Этот метод является высокоэффективным, что позволяет воспроизводиться прививки с U. maydis.
Abstract
Кукуруза является одной из основных зерновых культур во всем мире. Однако восприимчивость к биотрофическим патогенам является основным препятствием для повышения производительности. U. maydis является биотрофическим грибком патогена и возбудителем кукурузной головни на кукурузе. Это заболевание несет ответственность за значительные потери урожайности около $ 1,0 млрд в годв США 1 Несколько методов, включая севооборот, фунгицидов и семян лечения в настоящее время используются для контроля кукурузыголовне 2. Тем не менее, сопротивление хозяина является единственным практическим методом для управления кукурузной головне. Выявление сельскохозяйственных растений, включая кукурузу, пшеницу и рис, устойчивых к различным биотрофическим патогенам, значительно снизило потери урожайностиежегодно на 3-5. Таким образом, использование метода прививки патогена, который эффективно и воспроизводимо доставляет патоген между листьями растений, будет способствовать быстрой идентификации линий кукурузы, которые устойчивы к U. maydis. Как, первый шаг к indentifying линии кукурузы, которые устойчивы к U. maydis, метод инокуляции инъекции иглы и метод скрининга реакции сопротивления был использован для прививки кукурузы, теозинта и кукурузы x теозинтных интрогрессионных линий с штаммом U. maydis и для выбора устойчивых растений.
Кукуруза, тоозинте и кукуруза х teosinte интрогрессии линий, состоящий из около 700 растений, были посажены, привиты штаммом U. maydis, и скрининг на устойчивость. Методы прививки и скрининга успешно определили три линии тоозинта, устойчивые к U. maydis. Здесь представлен подробный протокол скрининга инъекций иглы и реакции сопротивления для кукурузы, тоозинта и кукурузы x teosinte интрогрессионных линий. Это исследование показывает, что прививка от инъекций иглы является бесценным инструментом в сельском хозяйстве, который может эффективно доставить U. maydis между листьями растений и предоставил растительные линии, которые устойчивы к U. maydis, которые теперь могут быть объединены и протестированы в программах разведения для улучшения устойчивости к болезням.
Introduction
Грибковые заболевания растений представляют собой одну из самых серьезных угроз сельскому хозяйству. Необходимость разработки сельскохозяйственных культур с повышением устойчивости к болезням возрастает в связи с потребностями в продовольствии растущего населения мира. Растительные патогены естественным образом инфицируют растениеводства в полевых условиях, вызывая заболевания, которые негативно влияют на урожайность6. Было показано, что выявление и использование устойчивых растений может повысить устойчивость и уменьшить потерю урожайности. Устойчивые сорта были выявлены во многих видах растений, включая кукурузу, пшеницу, рис и сорго путем инокулирования растений с патогеном растений и выбора для устойчивыхлиний 7. Таким образом, разработка и использование эффективного метода прививки позволили бы многим растениям быть привитыми и проверены на устойчивость. Различные методы прививки были использованы в том числе прививки падения, трубопроводов культуры подвески патогенных клеток в вихрь растения, и иглы инъекцийпрививки 8-11. С каждым методом, патоген должен надежно быть введен между листьями растений, где патоген попадает в растение через образование аппресории для обеспечения развития патогена иинфекции растений 12,13.
Метод прививки погружения включает погружение саженца растений в культуру подвески патогенных клеток, в то время как метод пипетки требует размещения культуры подвески патогенных клеток в вихрь саженца растений. Тем не менее, есть проблемы с обоими методами. Во-первых, оба метода зависят от естественного движения патогена от поверхности листа в ткань растения, которая является весьма переменной. Большинство патогенных микроорганизмов естественным образом попадают в растение через стоматальные отверстия или раны на поверхности листьев растений. Тем не менее, существует значительная изменчивость в способности патогенов проникать поверхности листьев растений через стомату и / или раны на поверхности листа. Таким образом, проникновение патогенов не может контролироваться ни с помощью метода прививки, потенциально приводящего к несовместимым данным. Во-вторых, при скрининге большого количества растений погружение саженцев в культуру подвески патогенных клеток может занять много времени и может ограничить количество растений, которые могут быть проверены. И наоборот, протокол прививки инъекций иглы, описанный в настоящем, обеспечивает культуру подвески патогенных клеток между листьями растений, способствуя образованию аппрессории14. Затем возбудитель использует недавно разработанную аппрессорию для входа на завод, устраняя проблему проникновения патогенов. Кроме того, протокол прививки от инъекций иглы содержит ряд фенотипов для растений кукурузы и тозинта, которые были привиты U. maydis и демонстрируют хорошую инфекцию. Фенотипы могут быть использованы в качестве маркера для определения наилучшей концентрации для культуры подвески патогенных клеток, что приводит к последовательной фенотипов растений внутри и между различными экспериментами.
После прививки растений с культурой подвески патогенных клеток, растения, как правило, проверяются для обнаружения резистентного или восприимчивогофенотипа 8-11,15. В то время как шкалы рейтинга заболеваний широко используются для проверки и классификации фенотипов растений, рейтинговые шкалы различаются в зависимости от анализируемого патогена. Таким образом, болезнь рейтинговой шкалы протокола создания для U. maydis и кукурузы взаимодействия могут быть использованы для аналогичных грибковых патогенов16.
В настоящей серии протоколов подробно иглы инъекции прививки с U. maydis клеточной подвески культуры и резистентности к болезням реакции скрининга кукурузы, тоозинта и кукурузы х teosinte интрогрессии линий. Нынешние протоколы не ограничиваются инъекцией иглы U. maydis в кукурузные растения, но могут быть использованы для относительно любого грибкового патогена и видов растений. Таким образом, включение деталей обоих методов в один и тот же протокол позволит исследователям непосредственно использовать протоколы для прививки и скрининга или манипулировать первоначальными протоколами, чтобы лучше соответствовать патогена и видов растений, представляющих интерес.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании метод прививки инъекций иглы, используемый для доставки штамма U. maydis в стебель 700 растений кукурузы и тоозинта, был успешным. Кроме того, была использована пересмотренная шкала рейтинга устойчивости к болезням для проверки растений и выявления развития патоген…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Эмира Исламовича за лабораторную и тепличную помощь. Мы также благодарим д-ра Шерри Флинт-Гарсия за предоставление кукурузы х teosinte интрогрессии линий.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Seed for plants | Collected from original crosses | ||
| Growth chamber | Conviron | PGR14 REACH-IN | |
| Planting flats | Hummert International | 14-3385-2 | |
| Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite) | Hummert International | 10-1059-2 | |
| Laminar flow hood | Lab Conoco | 70875372 | |
| Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest | Stocks were grown from original culture | ||
| Sterile loop | Fisher Scientific | S17356A | |
| Potato dextrose agar (PDA) plates | Fisher Scientific | R454311 | |
| Incubator set to 30 °C | Fisher Scientific | 11-690-650F | |
| Sterile toothpicks | Walmart | Purchased from Walmart and sterilized by autoclave | |
| Potato dextrose broth (PDB) | Fisher Scientific | ICN1008617 | |
| Incubator-shaker set to 30 °C | New Brunswick | 14-278-179 | |
| Spectrophotometer | Fisher Scientific | 4001000 | |
| U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml) | Grown from glycerol stock as described in the methods | ||
| 3 ml Syringes | Becton Dickinson | 309606 | |
| .457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles | Kendall Brands | 8881250321 |
References
- Smith, J. T. Crop fungal resistance developed using genetic engineering and antifungal proteins from viruses. , (2011).
- Sher, A. F., MacNab, A. A. . Vegetable diseases and their control. , 223-226 (1986).
- Crepet, W. L., Feldman, G. D. The earliest remains of grasses in the fossil record. Am. J. Bot. 78, 1010-1014 (1991).
- Iltis, H. H., Scoderstrom, T. R., Hilu, K. W., Campbell, C. S., Barkworth, M. E. Maize evolution and agricultural origins. Grass systematic and evolution. , 195-213 (1997).
- Mangelsdorf, P. C., Reeves, R. G. The origin of corn. III. Modern races, the product of tesonite. Bot. Mus. Leafl.. 18, 389-411 (1957).
- Agrios, G. N. . Plant Pathology. , (1997).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol. Plant. Pathol. 13, 414-430 (2012).
- Estrada, A. E., Jonkers, W., Kistler, H. C., May, G. Interactions beteen Fusarium verticillioides, Ustilago maydis, and Zea mays: An endophyte, a pathogen, and their shared plant host. Fung. Genet. Biol. 49, 578-587 (2012).
- Freeman, S., Rodriguez, R. J. A rapid technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp niveum and F. o. melonis on cucrbits. Plant Dis. 77, 1198-1201 (1993).
- Gottwald, T. R., Graham, J. H. A device for precise and nondisruptive stomatal inoculation of leaf tissue with bacterial pathogens. Phytopathol. 82, 930-935 (1992).
- Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Asomycota: Hypocreales). Mycolog. Res. 111, 748-757 (2007).
- Bolker, M., Bohnert, H. U., Braun, K. H., Gorl, J., Kahmann, R. Tagging pathogenicity genes in Ustilago maydis by restriction enzyme-mediated intergratior (REMI). Mol. Gen. Genet. 6, 274-283 (1991).
- Brachmann, A., Weinzierl, G., Kamper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 42, 1047-1063 (2001).
- Christensen, J. J. Corn smut caused by Ustilago maydis. Monograph number 2. , (1963).
- Skibbe, D. S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen. Sci.. 328, 89-92 (2010).
- Kamper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut. Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).
- Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize. , (1997).
- Gold, S. E., Kronstad, J. W. Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).
- Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. Ustilago maydis as a Pathogen. Annu. Rev. Phytopathol. 47, 423-445 (2005).
- Doehlemann, G., Wahl, R., Vranes, M., de Vries, R., Kämper, J., Kahmann, R. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystems. J. Plant Physiol. 165, 29-40 (2008).
- Reineke, G., Heinze, B., Schirawski, J., Buettner, H., Kahmann, R., Base, C. W. Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation. Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).
- Martínez-Espinoza, A., García-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems. Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).
- Banuett, F. Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize. Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).
- Keen, N. T. A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions. Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).
