Summary

Un metodo rapido ed efficiente per valutare la patogenicità dei maydis di Ustilago sulle linee di mais e teosinte

Published: January 03, 2014
doi:

Summary

Viene descritto l’uso di un metodo di iniezione dell’ago per inoculare il mais e le piante teosinte con l’agente patogeno biotrofico Ustilago maydis. Il metodo di inoculazione dell’iniezione dell’ago facilita la somministrazione controllata dell’agente patogeno fungino tra le foglie della pianta in cui l’agente patogeno entra nella pianta attraverso la formazione di appresoria. Questo metodo è altamente efficiente, consentendo inoculazioni riproducibili con U. maydis.

Abstract

Il mais è una delle principali colture cerealicole in tutto il mondo. Tuttavia, la suscettibilità agli agenti patogeni biotrofici è il vincolo primario per aumentare la produttività. U. maydis è un agente patogeno fungino biotrofico e l’agente causale del mais sul mais. Questa malattia è responsabile di perdite di resa significative di circa $ 1,0 miliardi all’anno negli StatiUniti 1 Diversi metodi tra cui la rotazione delle colture, l’applicazione di fungicidi e i trattamenti delle sementi sono attualmente utilizzati per controllare il mal di mais2. Tuttavia, la resistenza dell’ospite è l’unico metodo pratico per gestire il malumore di mais. L’identificazione delle piante coltivate tra cui mais, grano e riso resistenti a vari agenti patogeni biotrofi ha diminuito significativamente le perdite diresa ogni anno 3-5. Pertanto, l’uso di un metodo di inoculazione patogena che fornisca in modo efficiente e riproducibile l’agente patogeno tra le foglie delle piante, faciliterebbe la rapida identificazione delle linee di mais resistenti a U. maydis. Come, un primo passo verso l’identificazione delle linee di mais resistenti a U. maydis, un metodo di inoculazione dell’iniezione di ago e un metodo di screening della reazione di resistenza è stato utilizzato per inoculare le linee di introgressione di mais, teosinte e mais x teosinte con un ceppo di U. maydis e per selezionare piante resistenti.

Le linee di introgressione di mais, teosinte e mais x teosinte, costituite da circa 700 piante, sono state piantate, inoculate con un ceppo di U. maydise vengono schernite per la resistenza. I metodi di inoculazione e screening hanno identificato con successo tre linee di teosinte resistenti a U. maydis. Qui viene presentato un protocollo dettagliato di inoculazione dell’iniezione di ago e screening della reazione di resistenza per le linee di introgressione di mais, teosinte e mais x teosinte. Questo studio dimostra che l’inoculazione dell’iniezione di aghi è uno strumento inestimabile in agricoltura in grado di fornire efficacemente U. maydis tra le foglie delle piante e ha fornito linee vegetali resistenti a U. maydis che ora possono essere combinate e testate nei programmi di allevamento per una migliore resistenza alle malattie.

Introduction

Le malattie fungine delle piante rappresentano una delle minacce più eminenti per l’agricoltura. La necessità di sviluppare colture con una migliore resistenza alle malattie è in aumento a causa del fabbisogno alimentare di una popolazione mondiale in crescita. Gli agenti patogeni vegetali infettano naturalmente le piante coltivate sul campo causando malattie che hanno un impatto negativo sulla resa dellecolture 6. È stato dimostrato che identificare e utilizzare piante resistenti può migliorare la resistenza e ridurre la perdita di resa. Cultivar resistenti sono state identificate in molte specie vegetali tra cui mais, grano, riso e sorgo inoculando le piante con un agente patogeno vegetale e selezionando per linee resistenti7. Pertanto, lo sviluppo e l’uso di un metodo di inoculazione efficiente consentirebbero a molte piante di essere inoculate e vengono vengono utilizzati metodi di inoculazione e schermamento della resistenza. Sono stati utilizzati vari metodi di inoculazione tra cui l’inoculazione del tuffo, la pipettazione della coltura di sospensione delle cellule patogene nel vortice della pianta e l’inoculazione dell’iniezione diago 8-11. Con ogni metodo, l’agente patogeno deve essere introdotto in modo affidabile tra le foglie della pianta in cui l’agente patogeno entra nella pianta attraverso la formazione di appresoria per garantire lo sviluppo patogenoe l’infezione delle piante 12,13.

Il metodo di inoculazione del tuffo prevede l’immersione di una piantina vegetale in una coltura di sospensione cellulare patogena, mentre il metodo di pipettaggio richiede di posizionare la coltura di sospensione cellulare patogena nel vortice della piantina vegetale. Tuttavia, ci sono problemi con entrambi i metodi. In primo luogo, entrambi i metodi dipendono dal movimento naturale dell’agente patogeno dalla superficie fogliare nel tessuto vegetale che è altamente variabile. La maggior parte degli agenti patogeni entra naturalmente nella pianta attraverso aperture stomatali o ferite sulla superficie fogliare della pianta. Tuttavia, c’è una significativa variabilità nella capacità degli agenti patogeni di penetrare nella superficie fogliare vegetale attraverso gli stomi e / o le ferite sulla superficie fogliare. Pertanto, la penetrazione dell’agente patogeno non può essere controllata con un metodo di inoculazione che potrebbe portare a dati incoerenti. In secondo luogo, quando si vaglia un gran numero di piante, immergere le piantine in una coltura di sospensione cellulare patogena può richiedere molto tempo e può limitare il numero di piante che possono essere schermate. Al contrario, il protocollo di inoculazione dell’iniezione di ago descritto nel presente documento fornisce la coltura di sospensione cellulare patogena tra le foglie della pianta facilitando la formazione di appressoria14. L’agente patogeno utilizza quindi gli appressori di nuova sviluppo per entrare nella pianta eliminando il problema della penetrazione dell’agente patogeno. Inoltre, il protocollo di inoculazione dell’iniezione di ago fornisce una gamma di fenotipi per piante di mais e teosinte che sono state inoculate con U. maydis e dimostrano una buona infezione. I fenotipi possono essere usati come marcatore per determinare la migliore concentrazione per la coltura di sospensione cellulare patogena con conseguente fenotipi vegetali coerenti all’interno e tra diversi esperimenti.

A seguito dell’inoculazione delle piante con una coltura di sospensione cellulare patogena, le piante sono in genere schermate per rilevare un fenotipo resistente osuscettibile 8-11,15. Mentre le scale di valutazione della malattia sono state ampiamente utilizzate per schermare e classificare i fenotipi delle piante, le scale di classificazione differiscono a seconda dell’agente patogeno analizzato. Pertanto, uno stabilimento di protocollo sulla scala di classificazione delle malattie per le interazioni u. maydis e mais può essere utilizzato per agenti patogenifungini simili 16.

La presente serie di protocolli descrive in dettaglio l’inoculazione dell’iniezione di aghi con una coltura di sospensione cellulare U. maydis e lo screening della reazione di reazione di resistenza alle malattie di mais, teosinte e mais x linee di introgressione teosinte. I protocolli attuali non si limitano all’inoculazione dell’iniezione di aghi di U. maydis nelle piante di mais, ma possono essere utilizzati per relativamente qualsiasi agente patogeno fungino e specie vegetale. Pertanto, includere i dettagli di entrambi i metodi nello stesso protocollo consentirà ai ricercatori di utilizzare direttamente i protocolli per l’inoculazione e lo screening o di manipolare i protocolli originali per adattarsi meglio all’agente patogeno e alle specie vegetali di interesse.

Protocol

1. Crescita del materiale vegetale Selezionare le linee dell’impianto per l’inoculazione e lo screening. Per questo lavoro sono state utilizzate due linee di granturco, cinque linee di teosinte e quaranta linee di mais x teosinte con resistenza insolita agli U. maydis (tabella 1). Semi vegetali per esperimenti sperimentali(iniezione di U. maydis) e controllo (iniezione d’acqua) di inoculazione dell’ago. Eseguire questa questa cosa per ogni linea di piante. …

Representative Results

Un’inoculazione riuscita dell’iniezione di ago può essere determinata visualizzando il fenotipo delle piante inoculate con U. maydis (sperimentale). La maggior parte delle piante sperimentali erano suscettibili all’infezione da U. maydis. Le piante sensibili hanno mostrato uno sviluppo di malattie molto grave dimostrato dalla formazione di staminali e galle basali con teliospore nere(figure 3D e 3E, tabella 2). Diverse piante erano morte dopo l’inocul…

Discussion

In questo studio il metodo di inoculazione dell’iniezione di ago utilizzato per fornire un ceppo di U. maydis nel gambo di 700 piante di mais e teosinte ha avuto successo. Inoltre, è stata utilizzata una scala di valutazione della resistenza alle malattie rivista per migliorare le piante e rilevare lo sviluppo di agenti patogeni. Come risultato dell’utilizzo di entrambi i metodi, le linee vegetali resistenti agli U. maydis sono state identificate tra 700 piante di mais e teosinte che ora possono essere…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il Dott. Emir Islamovic per l’assistenza in laboratorio e in serra. Ringraziamo anche il Dr. Sherry Flint-Garcia per aver fornito le linee di introgressione mais x teosinte.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Seed for plants Collected from original crosses
Growth chamber Conviron PGR14 REACH-IN
Planting flats Hummert International 14-3385-2
Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite) Hummert International 10-1059-2
Laminar flow hood Lab Conoco 70875372
Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest Stocks were grown from original culture
Sterile loop Fisher Scientific S17356A
Potato dextrose agar (PDA) plates Fisher Scientific R454311
Incubator set to 30 °C Fisher Scientific 11-690-650F
Sterile toothpicks Walmart Purchased from Walmart and sterilized by autoclave
Potato dextrose broth (PDB) Fisher Scientific ICN1008617
Incubator-shaker set to 30 °C New Brunswick 14-278-179
Spectrophotometer Fisher Scientific 4001000
U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml) Grown from glycerol stock as described in the methods
3 ml Syringes Becton Dickinson 309606
.457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles Kendall Brands 8881250321

References

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Cite This Article
Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. J. Vis. Exp. (83), e50712, doi:10.3791/50712 (2014).

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