طريقة سريعة وفعالة لتقييم الإمراض في أوستيلاغو مايديس على خطوط الذرة والتيوسينت
Summary
يوصف استخدام طريقة حقن الإبر لتطعيم الذرة ونباتات التيوسينت مع مسببات الأمراض النيروبية الحيوية أوستيلاغو مايديس. تسهل طريقة تلقيح حقن الإبر التسليم المراقب لمسببات الأمراض الفطرية بين أوراق النبات حيث يدخل الممرض النبات من خلال تشكيل الأبريسوريا. هذه الطريقة هي فعالة للغاية، وتمكين التلقيح القابلة للاستنساخ مع U. maydis.
Abstract
الذرة هي محصول الحبوب الرئيسية في جميع أنحاء العالم. ومع ذلك، فإن التعرض لمسببات الأمراض الضوئية هو العائق الرئيسي أمام زيادة الإنتاجية. U. maydis هو مسببات الأمراض الفطرية التروفية الحيوية والعامل السببي لبذاءة الذرة على الذرة. هذا المرض هو المسؤول عن خسائر كبيرة في الغلة من حوالي 1.0 مليار دولار سنويا في الولايات المتحدة1 العديد من الطرق بما في ذلك تناوب المحاصيل، وتطبيق مبيد الفطريات وعلاجات البذور تستخدم حاليا للسيطرة على الذرة smut2. ومع ذلك ، فإن مقاومة المضيف هي الطريقة العملية الوحيدة لإدارة بذيء الذرة. وقد أدى تحديد النباتات المحصولية بما في ذلك الذرة والقمح والأرز المقاومة لمختلف مسببات الأمراض الحيوية إلى انخفاض كبير في خسائر الغلة سنويابنسبة 3-5. ولذلك، فإن استخدام طريقة التطعيم الممرض الذي يسلم بكفاءة واستنساخ الممرض بين أوراق النبات، من شأنه أن يسهل التحديد السريع لخطوط الذرة التي تقاوم ال MAYDIS U. كما, تم استخدام خطوة أولى نحو المسافة البادئة خطوط الذرة التي تقاوم مايديس U., طريقة حقن إبرة التلقيح وطريقة فحص رد فعل المقاومة لتطعيم الذرة, teosinte, والذرة x خطوط الاستبطان teosinte مع سلالة مايوديس U. واختيار النباتات المقاومة.
الذرة، التيوسينتي والذرة x خطوط الاستبطان التيوسينتي، التي تتكون من حوالي 700 نبات، زرعت، تلقيح مع سلالة من المايديس U.، وفحصها للمقاومة. طرق التلقيح والفحص حددت بنجاح ثلاثة خطوط teosinte مقاومة لU. maydis. هنا يتم تقديم حقن إبرة مفصلة بروتوكول فحص رد فعل المقاومة والذرة، التيوسينتي، والذرة x خطوط الاستبطان teosinte. توضح هذه الدراسة أن تلقيح حقن الإبر هو أداة لا تقدر بثمن في الزراعة التي يمكن أن توفر بكفاءة U. maydis بين أوراق النبات وقدمت خطوط نباتية مقاومة لل maydis U. التي يمكن دمجها واختبارها الآن في برامج التربية لتحسين مقاومة الأمراض.
Introduction
الأمراض الفطرية للنباتات تمثل واحدة من أبرز التهديدات للزراعة. وتتزايد الحاجة إلى تطوير محاصيل ذات مقاومة محسنة للأمراض بسبب الاحتياجات الغذائية لسكان العالم المتزايدين. مسببات الأمراض النباتية تصيب بشكل طبيعي النباتات الزراعية في الميدان مما تسبب في الأمراض التي تؤثر سلبا على غلة المحاصيل6. وقد ثبت أن تحديد واستخدام النباتات المقاومة يمكن أن يحسن المقاومة ويقلل من فقدان الغلة. وقد تم تحديد أصناف مقاومة في العديد من الأنواع النباتية بما في ذلك الذرة والقمح والأرز والذرة الرفيعة عن طريق تلقيح النباتات بمسببات الأمراض النباتية واختيار خطوط مقاومة7. ولذلك، فإن تطوير واستخدام طريقة تطعيم فعالة من شأنه أن يسمح بتطعيم العديد من النباتات وفحصها بحثا عن المقاومة. وقد استخدمت أساليب التلقيح المختلفة بما في ذلك انخفاض التطعيم، pipetting ثقافة تعليق الخلية الممرضة في دوامة النبات، والتلقيح حقن إبرة8-11. مع كل طريقة ، يجب إدخال الممرض بشكل موثوق بين أوراق النبات حيث يدخل الممرض النبات من خلال تشكيل appresoria لضمان تطور مسببات الأمراض والعدوى النباتية12،13.
تتضمن طريقة تلقيح الانخفاض غمر شتلة نباتية في ثقافة تعليق الخلايا المسببة للأمراض ، في حين أن طريقة الأنابيب تتطلب وضع ثقافة تعليق الخلية المسببة للأمراض في دوامة شتلة النبات. ومع ذلك، هناك مشاكل مع كلا الأسلوبين. أولا ، تعتمد كلتا الطريقتين على الحركة الطبيعية للمسبب الممرض من سطح الورق إلى الأنسجة النباتية التي هي متغيرة للغاية. معظم مسببات الأمراض تدخل بشكل طبيعي النبات من خلال فتحات الفم أو الجروح على سطح ورقة النبات. ومع ذلك ، هناك تباين كبير في قدرة مسببات الأمراض على اختراق سطح ورقة النبات من خلال stomata و / أو الجروح على سطح الورقة. لذلك، لا يمكن التحكم في اختراق مسببات الأمراض مع أي من طريقتي التطعيم التي يحتمل أن تؤدي إلى بيانات غير متسقة. ثانيا، عند فحص عدد كبير من النباتات، يمكن أن يكون غمر الشتلات في ثقافة تعليق الخلايا المسببة للأمراض مضيعة للوقت وقد يحد من عدد النباتات التي يمكن فحصها. على العكس من ذلك ، فإن بروتوكول حقن الإبر الموصوفة هنا يسلم ثقافة تعليق الخلية المسببة للأمراض بين أوراق النبات التي تسهل تشكيل appressoria14. ثم يستخدم العامل الممرض appressoria المطورة حديثا لدخول المصنع القضاء على مسألة اختراق مسببات الأمراض. بالإضافة إلى ذلك، يوفر بروتوكول تلقيح حقن الإبر مجموعة من الأنماط الظاهرية لنباتات الذرة والتيوسينت التي تم تلقيحها مع المايديس U. وإظهار عدوى جيدة. يمكن استخدام الأنماط الظاهرية كعلامة لتحديد أفضل تركيز لثقافة تعليق الخلايا المسببة للأمراض مما يؤدي إلى أنماط ظاهرة نباتية متسقة داخل التجارب المختلفة وفيما بينها.
بعد تلقيح النبات مع ثقافة تعليق الخلايا المسببة للأمراض ، يتم فحص النباتات عادة للكشف عن النمط الظاهري المقاوم أو المعرضللإصابة 8-11،15. في حين أن مقاييس تصنيف الأمراض قد استخدمت على نطاق واسع لفحص وتصنيف الأنماط الظاهرية النباتية، تختلف مقاييس التصنيف اعتمادا على العامل الممرض الذي يتم تحليله. لذلك ، يمكن استخدام إنشاء بروتوكول مقياس تصنيف المرض لتفاعلات المايديس والذرة في الكائنات الفطرية المماثلة16.
السلسلة الحالية من البروتوكولات تفاصيل حقن الإبرة التطعيم مع U. maydis تعليق الخلية الثقافة ومقاومة المرض فحص رد فعل الذرة، التيوسينتي، والذرة x خطوط الاستبطان teosinte. ولا تقتصر البروتوكولات الحالية على تلقيح حقن الإبر من المايديس U. في نباتات الذرة ولكن يمكن استخدامها لأي مسببات أمراض فطرية نسبيا والأنواع النباتية. ولذلك، فإن إدراج تفاصيل كلا الأسلوبين في البروتوكول نفسه سيمكن الباحثين من الاستفادة المباشرة من البروتوكولات للتلقيح والفحص أو التلاعب بالبروتوكولات الأصلية لتناسب بشكل أفضل الأنواع الممرضة والنباتية ذات الاهتمام.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة كانت طريقة حقن الإبر المستخدمة لتوصيل سلالة من المايديس U. في جذع 700 نبات الذرة والتيوسينت ناجحة. وبالإضافة إلى ذلك، استخدم مقياس منقح لتصنيف مقاومة الأمراض لفحص النباتات والكشف عن تطور مسببات الأمراض. ونتيجة لاستخدام كلتا الطريقتين، تم تحديد خطوط نباتية مقاومة للما?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر الدكتور أمير إسلاموفيتش على المساعدة المختبرية ومساعدة الدفيئة. كما نشكر الدكتورة شيري فلينت غارسيا على توفير خطوط الاستبطان الذرة x teosinte.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Seed for plants | Collected from original crosses | ||
| Growth chamber | Conviron | PGR14 REACH-IN | |
| Planting flats | Hummert International | 14-3385-2 | |
| Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite) | Hummert International | 10-1059-2 | |
| Laminar flow hood | Lab Conoco | 70875372 | |
| Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest | Stocks were grown from original culture | ||
| Sterile loop | Fisher Scientific | S17356A | |
| Potato dextrose agar (PDA) plates | Fisher Scientific | R454311 | |
| Incubator set to 30 °C | Fisher Scientific | 11-690-650F | |
| Sterile toothpicks | Walmart | Purchased from Walmart and sterilized by autoclave | |
| Potato dextrose broth (PDB) | Fisher Scientific | ICN1008617 | |
| Incubator-shaker set to 30 °C | New Brunswick | 14-278-179 | |
| Spectrophotometer | Fisher Scientific | 4001000 | |
| U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml) | Grown from glycerol stock as described in the methods | ||
| 3 ml Syringes | Becton Dickinson | 309606 | |
| .457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles | Kendall Brands | 8881250321 |
References
- Smith, J. T. Crop fungal resistance developed using genetic engineering and antifungal proteins from viruses. , (2011).
- Sher, A. F., MacNab, A. A. . Vegetable diseases and their control. , 223-226 (1986).
- Crepet, W. L., Feldman, G. D. The earliest remains of grasses in the fossil record. Am. J. Bot. 78, 1010-1014 (1991).
- Iltis, H. H., Scoderstrom, T. R., Hilu, K. W., Campbell, C. S., Barkworth, M. E. Maize evolution and agricultural origins. Grass systematic and evolution. , 195-213 (1997).
- Mangelsdorf, P. C., Reeves, R. G. The origin of corn. III. Modern races, the product of tesonite. Bot. Mus. Leafl.. 18, 389-411 (1957).
- Agrios, G. N. . Plant Pathology. , (1997).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol. Plant. Pathol. 13, 414-430 (2012).
- Estrada, A. E., Jonkers, W., Kistler, H. C., May, G. Interactions beteen Fusarium verticillioides, Ustilago maydis, and Zea mays: An endophyte, a pathogen, and their shared plant host. Fung. Genet. Biol. 49, 578-587 (2012).
- Freeman, S., Rodriguez, R. J. A rapid technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp niveum and F. o. melonis on cucrbits. Plant Dis. 77, 1198-1201 (1993).
- Gottwald, T. R., Graham, J. H. A device for precise and nondisruptive stomatal inoculation of leaf tissue with bacterial pathogens. Phytopathol. 82, 930-935 (1992).
- Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Asomycota: Hypocreales). Mycolog. Res. 111, 748-757 (2007).
- Bolker, M., Bohnert, H. U., Braun, K. H., Gorl, J., Kahmann, R. Tagging pathogenicity genes in Ustilago maydis by restriction enzyme-mediated intergratior (REMI). Mol. Gen. Genet. 6, 274-283 (1991).
- Brachmann, A., Weinzierl, G., Kamper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 42, 1047-1063 (2001).
- Christensen, J. J. Corn smut caused by Ustilago maydis. Monograph number 2. , (1963).
- Skibbe, D. S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen. Sci.. 328, 89-92 (2010).
- Kamper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut. Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).
- Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize. , (1997).
- Gold, S. E., Kronstad, J. W. Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).
- Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. Ustilago maydis as a Pathogen. Annu. Rev. Phytopathol. 47, 423-445 (2005).
- Doehlemann, G., Wahl, R., Vranes, M., de Vries, R., Kämper, J., Kahmann, R. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystems. J. Plant Physiol. 165, 29-40 (2008).
- Reineke, G., Heinze, B., Schirawski, J., Buettner, H., Kahmann, R., Base, C. W. Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation. Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).
- Martínez-Espinoza, A., García-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems. Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).
- Banuett, F. Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize. Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).
- Keen, N. T. A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions. Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).
