Summary

שיטה מהירה ויעילה להערכת פתוגניות של מיאדי אוסטילגו על קווי תירס וטוסינטה

Published: January 03, 2014
doi:

Summary

השימוש בשיטת הזרקת מחט לחסן תירס וצמחי teosinte עם פתוגן ביוטרופי Ustilago maydis מתואר. שיטת החיסון להזרקת מחט מקלה על מסירה מבוקרת של הפתוגן הפטרייתי בין עלי הצמח שבהם הפתוגן נכנס לצמח באמצעות היווצרות appresoria. שיטה זו יעילה ביותר, ומאפשרת חיסונים הניתנים לשחזור עם U. maydis.

Abstract

תירס הוא יבול דגנים גדול ברחבי העולם. עם זאת, רגישות לפתוגנים ביוטרופיים היא האילוץ העיקרי להגברת הפרודוקטיביות. U. maydis הוא פתוגן פטרייתי ביוטרופי והסוכן הסיבתי של תות תירס על תירס. מחלה זו אחראית להפסדי תשואה משמעותיים של כ -1.0 מיליארד דולר בשנה בארה”ב. 1 מספר שיטות כולל סיבוב יבול,יישום קוטלי פטריות וטיפולי זרעים משמשים כיום כדי לשלוט תירס smut2. עם זאת, התנגדות המארח היא השיטה המעשית היחידה לניהול smut תירס. זיהוי של צמחי יבול כולל תירס, חיטה ואורז העמידים לפתוגנים ביוטרופיים שונים הפחית באופן משמעותי את הפסדי התשואה מדי שנה3-5. לכן, השימוש בשיטת חיסון פתוגן המספקת ביעילות ובאופן רב את הפתוגן בין עלי הצמח, יקל על זיהוי מהיר של קווי תירס העמידים בפני U. maydis. כמו, צעד ראשון לקראת החדירה קווי תירס עמידים U. maydis, שיטת חיסון הזרקת מחט ושיטת הקרנה תגובת התנגדות נוצל כדי לחסן תירס, teosinte, ו תירס x teosinte קווי התבוננות עם U. maydis זן ולבחור צמחים עמידים.

קווי התבוננות פנימה של תירס, טאוסינט ותירס x טאוסינט, המורכבים מכ-700 צמחים, נשתלו, חוסנו בזן של מידיס אמריקאי, והוקרנו להתנגדות. שיטות החיסון והסינון זיהו בהצלחה שלושה קווי teosinte עמידים בפני U. maydis. כאן מוצג פרוטוקול סינון מפורט של חיסון הזרקת מחט ותגובת התנגדות לקווי גירוי תירס, טאוסינט ותירס x teosinte. מחקר זה מדגים כי חיסון הזרקת מחט הוא כלי שלא יסולא בפז בחקלאות שיכול לספק ביעילות U. maydis בין עלי הצמח וסיפק קווי צמחים עמידים U. maydis כי עכשיו ניתן לשלב ולבדוק בתוכניות הרבייה עבור עמידות למחלות משופרת.

Introduction

מחלות פטרייתיות של צמחים מייצגות את אחד האיומים הבולטים ביותר על החקלאות. הצורך לפתח יבולים עם עמידות משופרת למחלות הולך וגדל בשל צורכי המזון של אוכלוסיית העולם ההולכת וגדלה. פתוגנים צמחיים מדביקים באופן טבעי צמחי יבולים בתחום וגורמים למחלות המשפיעות לרעה על יבול6. הוכח כי זיהוי וניצול צמחים עמידים יכול לשפר את ההתנגדות ולהפחית את אובדן התשואה. זנים עמידים זוהו במיני צמחים רבים, כולל תירס, חיטה, אורז ובדורה על ידי כך שהם מחוסנים את הצמחים בפתוגן צמחי ובוחרים לקווים עמידים7. לכן, פיתוח ושימוש בשיטת חיסון יעילה יאפשרו לצמחים רבים להיות מחוסנים ומוקרנים להתנגדות. שיטות חיסון שונות שימשו כולל חיסון לטבול, pipeting את תרבות ההשעיה תא פתוגן לתוך המערבולת של הצמח, וחיסון הזרקת מחט8-11. עם כל שיטה, הפתוגן חייב להיות הציג באופן אמין בין הצמח עוזב שבו הפתוגן נכנס לצמח באמצעות היווצרות של appresoria כדי להבטיח פיתוח פתוגן וזיהום צמחי12,13.

שיטת חיסון הטבילה כרוכה בהשקעת שתיל צמחי לתוך תרבות השעיית תאים פתוגן, בעוד שיטת הצינור דורשת הצבת תרבות המתלים של תאי הפתוגן למערבולת של שתיל הצמח. עם זאת, קיימות בעיות בשתי השיטות. ראשית, שתי השיטות תלויות בתנועה הטבעית של הפתוגן מפני השטח של העלה לרקמת הצמח המשתנה מאוד. רוב הפתוגנים נכנסים באופן טבעי לצמח דרך פתחים סטומטליים או פצעים על פני השטח של עלה הצמח. עם זאת, קיימת שונות משמעותית ביכולת הפתוגנים לחדור את משטח עלה הצמח דרך הסטומטה ו/או הפצעים על פני העלה. לכן, חדירת פתוגן לא ניתן לשלוט עם כל שיטת חיסון פוטנציאל וכתוצאה מכך נתונים לא עקביים. שנית, כאשר סינון מספר רב של צמחים, שקיעת השתילים לתוך תרבות השעיית תא פתוגן יכול להיות זמן רב ועשוי להגביל את מספר הצמחים שניתן לסנן. לעומת זאת, פרוטוקול חיסון הזרקת המחט המתואר בזאת מספק את תרבות ההשעיה של תאי הפתוגן בין עלי הצמח המקלים על היווצרותנספחים 14. לאחר מכן הפתוגן מנצל את התוספתן החדש שפותח כדי להיכנס לצמח ומבטל את בעיית החדירה לפתוגן. בנוסף, פרוטוקול חיסון הזרקת מחט מספק מגוון של פנוטיפים עבור תירס וצמחי teosinte כי כבר מחוסנים עם U. maydis ולהפגין זיהום טוב. הפנוטיפים יכולים לשמש כסמן כדי לקבוע את הריכוז הטוב ביותר עבור תרבות השעיית תאי הפתוגן וכתוצאה מכך פנוטיפים צמחיים עקביים בתוך ובין ניסויים שונים.

בעקבות חיסון צמחים עם תרבות השעיית תא פתוגן, צמחים מוקרנים בדרך כלל כדי לזהות פנוטיפ עמיד או רגיש8-11,15. בעוד קשקשי דירוג המחלות נמצאים בשימוש נרחב כדי לסנן ולסווג פנוטיפים צמחיים, סולמות הדירוג משתנים בהתאם לפתוגן המנותח. לכן, הקמת פרוטוקול סולם דירוג מחלה עבור U. maydis ו אינטראקציות תירס יכול להיות מנוצל עבור פתוגנים פטרייתי דומה16.

סדרת הפרוטוקולים הנוכחית מפרטת חיסון הזרקת מחט עם תרבות השעיית תאים U. maydis והקרנת תגובת עמידות למחלות של תירס, טאוסינט וקווי אינטרוגרסיה של תירס x teosinte. הפרוטוקולים הנוכחיים אינם מוגבלים לחיסון הזרקת מחט של U. maydis לתוך צמחים תירס אבל יכול להיות מנוצל עבור כל פתוגן פטרייתי יחסית מיני צמחים. לכן, הכללת הפרטים של שתי השיטות באותו פרוטוקול תאפשר לחוקרים לנצל ישירות את הפרוטוקולים לחיסון וסינון או לתפעל את הפרוטוקולים המקוריים כך שיתאימו טוב יותר למיני הפתוגן והצמחים המעניינים.

Protocol

1. צמיחת חומר צמחי בחר קווי צמח לחיסון והקרנה. שני קווי תירס, חמישה קווי teosinte, וארבעים קווי תירס x teosinte עם התנגדות לא אופיינית U. maydis שימשו עבור עבודה זו (טבלה 1). זרעי צמחים לניסויים (הזרקתמיאדיס U) ושליטה (הזרקת מים) ניסויי חיסון הזרקת מחט. עשה זאת עבור כל קו צמח. …

Representative Results

חיסון מוצלח להזרקת מחט יכול להיקבע על ידי הדמיה של הפנוטיפ של הצמחים מחוסנים עם U. maydis (ניסיוני). רוב הצמחים הניסיוניים היו רגישים לזיהום U. maydis. הצמחים הרגישים הראו התפתחות מחלה חמורה מאוד שהודגמה על ידי היווצרות גזע ותמר בסיסי עם teliospores שחור(איורים 3D ו 3E, טבל?…

Discussion

במחקר זה שיטת החיסון הזרקת מחט המשמשת כדי לספק זן של U. maydis לתוך הגבעול של 700 תירס וצמחי teosinte היה מוצלח. בנוסף, סולם דירוג עמידות למחלות מתוקן שימש כדי לסנן את הצמחים ולזהות התפתחות פתוגן. כתוצאה משימוש בשתי השיטות, זוהו קווי צמחים עמידים בפני מיאדיס U. בקרב 700 צמחי תירס וטוסינט שכעת ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לד”ר אמיר איסלמוביץ’ על הסיוע במעבדה ובחממה. אנו מודים גם לד”ר שרי פלינט-גרסיה שסיפקה את קווי ההפנמה של תירס x טאוסינט.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Seed for plants Collected from original crosses
Growth chamber Conviron PGR14 REACH-IN
Planting flats Hummert International 14-3385-2
Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite) Hummert International 10-1059-2
Laminar flow hood Lab Conoco 70875372
Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest Stocks were grown from original culture
Sterile loop Fisher Scientific S17356A
Potato dextrose agar (PDA) plates Fisher Scientific R454311
Incubator set to 30 °C Fisher Scientific 11-690-650F
Sterile toothpicks Walmart Purchased from Walmart and sterilized by autoclave
Potato dextrose broth (PDB) Fisher Scientific ICN1008617
Incubator-shaker set to 30 °C New Brunswick 14-278-179
Spectrophotometer Fisher Scientific 4001000
U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml) Grown from glycerol stock as described in the methods
3 ml Syringes Becton Dickinson 309606
.457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles Kendall Brands 8881250321

References

  1. Smith, J. T. Crop fungal resistance developed using genetic engineering and antifungal proteins from viruses. , (2011).
  2. Sher, A. F., MacNab, A. A. . Vegetable diseases and their control. , 223-226 (1986).
  3. Crepet, W. L., Feldman, G. D. The earliest remains of grasses in the fossil record. Am. J. Bot. 78, 1010-1014 (1991).
  4. Iltis, H. H., Scoderstrom, T. R., Hilu, K. W., Campbell, C. S., Barkworth, M. E. Maize evolution and agricultural origins. Grass systematic and evolution. , 195-213 (1997).
  5. Mangelsdorf, P. C., Reeves, R. G. The origin of corn. III. Modern races, the product of tesonite. Bot. Mus. Leafl.. 18, 389-411 (1957).
  6. Agrios, G. N. . Plant Pathology. , (1997).
  7. Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol. Plant. Pathol. 13, 414-430 (2012).
  8. Estrada, A. E., Jonkers, W., Kistler, H. C., May, G. Interactions beteen Fusarium verticillioides, Ustilago maydis, and Zea mays: An endophyte, a pathogen, and their shared plant host. Fung. Genet. Biol. 49, 578-587 (2012).
  9. Freeman, S., Rodriguez, R. J. A rapid technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp niveum and F. o. melonis on cucrbits. Plant Dis. 77, 1198-1201 (1993).
  10. Gottwald, T. R., Graham, J. H. A device for precise and nondisruptive stomatal inoculation of leaf tissue with bacterial pathogens. Phytopathol. 82, 930-935 (1992).
  11. Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Asomycota: Hypocreales). Mycolog. Res. 111, 748-757 (2007).
  12. Bolker, M., Bohnert, H. U., Braun, K. H., Gorl, J., Kahmann, R. Tagging pathogenicity genes in Ustilago maydis by restriction enzyme-mediated intergratior (REMI). Mol. Gen. Genet. 6, 274-283 (1991).
  13. Brachmann, A., Weinzierl, G., Kamper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 42, 1047-1063 (2001).
  14. Christensen, J. J. Corn smut caused by Ustilago maydis. Monograph number 2. , (1963).
  15. Skibbe, D. S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen. Sci.. 328, 89-92 (2010).
  16. Kamper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
  17. Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut. Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).
  18. Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize. , (1997).
  19. Gold, S. E., Kronstad, J. W. Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).
  20. Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. Ustilago maydis as a Pathogen. Annu. Rev. Phytopathol. 47, 423-445 (2005).
  21. Doehlemann, G., Wahl, R., Vranes, M., de Vries, R., Kämper, J., Kahmann, R. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystems. J. Plant Physiol. 165, 29-40 (2008).
  22. Reineke, G., Heinze, B., Schirawski, J., Buettner, H., Kahmann, R., Base, C. W. Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation. Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).
  23. Martínez-Espinoza, A., García-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems. Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).
  24. Banuett, F. Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize. Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).
  25. Keen, N. T. A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions. Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).

Play Video

Cite This Article
Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. J. Vis. Exp. (83), e50712, doi:10.3791/50712 (2014).

View Video