トウモロコシとテオシンテ線における ウスチラゴ の病原性を評価するための迅速かつ効率的な方法
Summary
メズおよびテオシンテ植物を生物栄養病原体 ウスチラゴメイディス で接種する注射法の使用について説明する。 針注射接種方法は、病原体がアプリソリアの形成を通じて植物に入る植物葉の間の真菌病原体の制御された送達を促進する。この方法は非常に効率的で 、U.maydisで再現可能な接種を可能にします。
Abstract
トウモロコシは世界中の主要な穀物作物です。しかし、生物栄養病原体に対する感受性は、生産性を高めるための主要な制約である。 U.maydis は、トウモロコシの生物栄養真菌病原体およびトウモロコシスムートの因果剤である。この病気は、米国で年間約10億ドルの著しい収量損失を引き起こします1 作物の回転を含むいくつかの方法, 殺菌剤の適用と種子治療は、現在、トウモロコシのスマットを制御するために使用されています2.しかし、ホスト抵抗は、トウモロコシスマットを管理するための唯一の実用的な方法です。種々の生物栄養病原体に耐性のあるトウモロコシ、小麦、米などの作物植物の同定は、毎年3〜5の収量損失を著しく減少させている。したがって、植物葉間で病原体を効率的かつ再現的に送達する病原体接種方法を用いることは 、U.maydisに耐性のあるトウモロコシ株の迅速な同定を容易にするであろう。として 、U.maydisに耐性のあるトウモロコシラインを識別するための第一歩として、ニードル注射接種法および抵抗反応スクリーニング方法を利用して、トウモロコシ、テオシンテ、トウモロコシxテオシンテイントログレスラインを U.maydis 株で接種し、耐性植物を選択した。
トウモロコシ、テオシンテ及びトウモロコシxテオシンテ内線は、約700の植物からなる、植え付け 、U.maydisの株で接種し、抵抗性をスクリーニングした。接種およびスクリーニング方法は 、U.maydisに耐性のある3つのテオシンテ線を同定することに成功した。ここでは、トウモロコシ、テオシンテ、及びトウモロコシxテオシンテイントログレスラインの詳細な注射接種及び抵抗反応スクリーニングプロトコルが提示される。この研究は、針注射接種が植物の葉の間に U.maydis を効率的に供給できる農業における貴重なツールであり、現在組み合わせることができ、改善された疾患耐性のための繁殖プログラムでテストすることができる U.maydis に耐性のある植物ラインを提供していることを示しています。
Introduction
植物の真菌病は、農業に対する最も重要な脅威の1つを表しています。世界人口の増加に伴い、食のニーズが高まる中、耐病性の向上を伴う作物の開発が必要とされています。植物病原体は自然に作物収量に悪影響を与える疾患を引き起こすフィールドの作物植物に感染する 6.耐性植物を同定し、利用することは抵抗を改善し、収量損失を減少させることができることが示されている。植物病原体を植物に接種し、耐性ライン7を選択することにより、トウモロコシ、小麦、米、ソルガムを含む多くの植物種において耐性品種が同定されている。したがって、効率的な接種方法の開発と使用は、多くの植物を接種し、抵抗性のためにスクリーニングすることを可能にするであろう。浸入接種、病原体細胞懸濁培養を植物の渦にピペット化、注射注射8~11の注射など様々な接種方法が用いられている。各方法を用いて、病原体は、病原体の発達と植物感染を確実に行うために、アプレソリアの形成を通じて植物に入る植物葉の間に確実に導入されなければならない。
浸潤接種法は、植物苗を病原体細胞懸濁培養物に浸入することを含み、ピペット法では病原体細胞懸濁液を植物苗の渦に入れる必要がある。ただし、両方の方法に問題があります。第一に、どちらの方法も、葉表面から植物組織への病原体の自然な動きに依存する。ほとんどの病原体は、自然に植物の葉表面に口孔や傷を介して植物に入ります.しかし、植物の葉表面を通して植物葉表面を貫通する病原体能力や葉表面の創傷には大きなばらつきがある。したがって、病原体の浸透は、いずれの接種方法でも制御できず、データの一貫性がなくなる可能性があります。第二に、多数の植物をスクリーニングする場合、苗を病原体細胞懸濁培養物に浸すと時間がかかり、スクリーニングできる植物の数を制限する可能性がある。逆に、本明細書に記載の針注射接種プロトコルは、アプレッサリア14の形成を促進する植物葉間の病原体細胞懸濁培養を送達する。病原体は、次に、新たに開発されたアプレッサリアを利用して、病原体の侵入問題を排除する植物に入ります。さらに、針注射接種プロトコルは、メイズおよびテオシンテ植物に対して 、U.maydis を接種し、良好な感染を示す様々なフェノタイプを提供する。この表現型は、異なる実験内および実験間で一貫した植物表現型をもたらす病原体細胞懸濁液培養に最適な濃度を決定するためのマーカーとして使用することができる。
病原体細胞懸濁液培養による植物接種後、植物は通常、8-11,15の耐性または感受性表現型を検出するためにスクリーニングされる。疾患評価尺度は植物の型をスクリーニングし、分類するために広く使用されているが、評価尺度は分析される病原体によって異なる。したがって、 米国メイディス およびトウモロコシ相互作用に対する疾患評価尺度プロトコル確立は、同様の真菌病原体16に利用することができる。
本シリーズのプロトコルは、 メイ ズ細胞懸濁液培養およびトウモロコシ、テオシンテ、およびトウモロコシxテオシンテイントログレスラインの疾患耐性反応スクリーニングによる針注射接種を詳述している。本プロトコルは、トウモロコシ植物への U.maydis の注射の針に限定されるものではなく、比較的あらゆる真菌病原体および植物種に利用することができる。したがって、同じプロトコルに両方の方法の詳細を含めると、研究者は接種とスクリーニングのためのプロトコルを直接利用したり、元のプロトコルを操作して目的の病原体および植物種により適合することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、700トウモロコシとテオシンテ植物の茎に U.maydis の株を送達するために使用される針注射接種方法が成功した。さらに、改訂された疾患耐性評価尺度を使用して、植物をスクリーニングし、病原体の発達を検出した。両方の方法を使用した結果 、U.maydis に耐性のある植物ラインが700トウモロコシとテオシンテ植物の間で同定され、現在は組み合わせることができ、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
エミール・イスラモビッチ博士の研究室と温室支援に感謝します。また、シェリー・フリント・ガルシア博士がトウモロコシ×テオシンテのイントログレスラインを提供してくれたことに感謝します。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Seed for plants | Collected from original crosses | ||
| Growth chamber | Conviron | PGR14 REACH-IN | |
| Planting flats | Hummert International | 14-3385-2 | |
| Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite) | Hummert International | 10-1059-2 | |
| Laminar flow hood | Lab Conoco | 70875372 | |
| Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest | Stocks were grown from original culture | ||
| Sterile loop | Fisher Scientific | S17356A | |
| Potato dextrose agar (PDA) plates | Fisher Scientific | R454311 | |
| Incubator set to 30 °C | Fisher Scientific | 11-690-650F | |
| Sterile toothpicks | Walmart | Purchased from Walmart and sterilized by autoclave | |
| Potato dextrose broth (PDB) | Fisher Scientific | ICN1008617 | |
| Incubator-shaker set to 30 °C | New Brunswick | 14-278-179 | |
| Spectrophotometer | Fisher Scientific | 4001000 | |
| U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml) | Grown from glycerol stock as described in the methods | ||
| 3 ml Syringes | Becton Dickinson | 309606 | |
| .457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles | Kendall Brands | 8881250321 |
References
- Smith, J. T. Crop fungal resistance developed using genetic engineering and antifungal proteins from viruses. , (2011).
- Sher, A. F., MacNab, A. A. . Vegetable diseases and their control. , 223-226 (1986).
- Crepet, W. L., Feldman, G. D. The earliest remains of grasses in the fossil record. Am. J. Bot. 78, 1010-1014 (1991).
- Iltis, H. H., Scoderstrom, T. R., Hilu, K. W., Campbell, C. S., Barkworth, M. E. Maize evolution and agricultural origins. Grass systematic and evolution. , 195-213 (1997).
- Mangelsdorf, P. C., Reeves, R. G. The origin of corn. III. Modern races, the product of tesonite. Bot. Mus. Leafl.. 18, 389-411 (1957).
- Agrios, G. N. . Plant Pathology. , (1997).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol. Plant. Pathol. 13, 414-430 (2012).
- Estrada, A. E., Jonkers, W., Kistler, H. C., May, G. Interactions beteen Fusarium verticillioides, Ustilago maydis, and Zea mays: An endophyte, a pathogen, and their shared plant host. Fung. Genet. Biol. 49, 578-587 (2012).
- Freeman, S., Rodriguez, R. J. A rapid technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp niveum and F. o. melonis on cucrbits. Plant Dis. 77, 1198-1201 (1993).
- Gottwald, T. R., Graham, J. H. A device for precise and nondisruptive stomatal inoculation of leaf tissue with bacterial pathogens. Phytopathol. 82, 930-935 (1992).
- Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Asomycota: Hypocreales). Mycolog. Res. 111, 748-757 (2007).
- Bolker, M., Bohnert, H. U., Braun, K. H., Gorl, J., Kahmann, R. Tagging pathogenicity genes in Ustilago maydis by restriction enzyme-mediated intergratior (REMI). Mol. Gen. Genet. 6, 274-283 (1991).
- Brachmann, A., Weinzierl, G., Kamper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 42, 1047-1063 (2001).
- Christensen, J. J. Corn smut caused by Ustilago maydis. Monograph number 2. , (1963).
- Skibbe, D. S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen. Sci.. 328, 89-92 (2010).
- Kamper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut. Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).
- Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize. , (1997).
- Gold, S. E., Kronstad, J. W. Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).
- Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. Ustilago maydis as a Pathogen. Annu. Rev. Phytopathol. 47, 423-445 (2005).
- Doehlemann, G., Wahl, R., Vranes, M., de Vries, R., Kämper, J., Kahmann, R. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystems. J. Plant Physiol. 165, 29-40 (2008).
- Reineke, G., Heinze, B., Schirawski, J., Buettner, H., Kahmann, R., Base, C. W. Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation. Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).
- Martínez-Espinoza, A., García-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems. Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).
- Banuett, F. Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize. Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).
- Keen, N. T. A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions. Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).
