En este trabajo se describen los procedimientos para la estimulación táctil de crías de rata y la posterior tinción de Golgi-Cox de la morfología neuronal. Estímulo táctil es una experiencia positiva que se administra en el periodo perinatal por acariciar cachorros con un plumero hogar. Tinción de Golgi-Cox es un procedimiento confiable que permite la visualización de las neuronas enteras.
Para generar cambios a largo plazo en el comportamiento, las experiencias deben estar produciendo cambios estables en la morfología neuronal y la conectividad sináptica. La estimulación táctil es una primera experiencia positiva que imita materno lamiendo y aseo en la rata. La exposición de las crías de rata a esta experiencia positiva se puede completar con facilidad y de manera rentable mediante el uso de materiales altamente accesibles, como un plumero hogar. Utilizando un diseño cruzado camada, los cachorros están bien acariciaron o molestar, durante 15 minutos, tres veces al día durante todo el período perinatal. Para medir los cambios neuroplásticos relacionados con esta primera experiencia positiva, se utiliza la tinción de Golgi-Cox del tejido cerebral. Debido al hecho de que de Golgi-Cox impregnación tiñe un número discreto de neuronas en vez de todas las células, la tinción del cerebro de roedores con solución de Golgi-Cox permite la visualización de elementos neuronales enteras, incluyendo el cuerpo celular, las dendritas, axones, y espinas dendríticas. El procedimiento de tinción is lleva a cabo durante varios días y requiere que el investigador prestar mucha atención a los detalles. Sin embargo, una vez que se haya completado la tinción, todo el cerebro se ha impregnado y puede ser conservada indefinidamente para el análisis en curso. Por lo tanto, la tinción de Golgi-Cox es un recurso valioso para el estudio de la experiencia que dependen de la plasticidad.
Aunque hay muchas técnicas notificados y utilizados para el examen de las primeras experiencias negativas en la maduración del cerebro, tales como el estrés perinatal 1,2, la privación sensorial 3, y la toxicidad de drogas 4, hay muy pocas metodologías empleadas para examinar los efectos de las experiencias positivas en este período de tiempo. Aparte de enriquecimiento ambiental, estimulación táctil es uno de los pocos cerebro mejora de los tratamientos con efectos demostrados 5. La estimulación táctil es un método de estimulación sensorial de la piel que imita el comportamiento de las ratas materna, lamiendo y aseo personal. Su aceptación general como una manipulación positiva surge de estudios que indican que la estimulación táctil mejora la maduración de los bebés prematuros y ratas recién nacidas 6. Además, la investigación en el laboratorio Meaney 7 ha demostrado que los niveles más altos de lamido de la madre y el aseo están vinculados a los resultados positivos en los hijos. Debido a Tinfluencias positivas stos, estimulación táctil evolucionaron rápidamente en una estrategia de recuperación destinado a reducir la ansiedad 8, la mejora de los resultados asociados con lesión cerebral 9-11, y atenuando la sensibilización de drogas 12. Como tal, la estimulación táctil es una técnica valiosa para la promoción de las primeras experiencias positivas, con una probada capacidad para reorganizar drásticamente la morfología neuronal y la conectividad sináptica del cerebro en desarrollo.
Con el fin de examinar y cuantificar los cambios en la morfología neuronal, que es necesario para visualizar las neuronas intactas. El procedimiento de tinción de Golgi-Cox es una modificación de la técnica de Camillo Golgi publicado a finales de 1800 que proporciona tinción discreta de un pequeño número de neuronas completas 13. Aunque el procedimiento parece manchar las neuronas al azar y reproducibilidad se cita comúnmente como principal defecto, el permiso de pequeña tasa de impregnación visualización de todo el elemento neuronal, incluyendo cecuerpos ll, dendritas, espinas dendríticas y axones. Del mismo modo, el tiempo requerido para impregnar un cerebro dado con una solución de Golgi también ha sido citada como una caída. Sin embargo, dado que una vez que la tinción es tejido completa se puede conservar indefinidamente, y el tiempo entre la perfusión del cerebro y la visualización de las neuronas con un microscopio se puede completar en menos de 21 días, el período de tiempo no es irrazonable. Además, con modificaciones menores en el protocolo, la tinción de Golgi-Cox se puede utilizar eficazmente para impregnar cerebros de roedores de todos los rangos de edad. Como los cambios a nivel estructural se han relacionado con las modificaciones persistentes para el funcionamiento conductual y psicológica, la técnica de tinción de Golgi-Cox proporciona a los investigadores una herramienta valiosa para medir la neuroplasticidad.
Debido a la plasticidad explícita del cerebro en desarrollo, es importante que los procedimientos experimentales con experiencias tempranas son revisados a fondo y se hacen intentos de controlar todas las variables que intervienen. Por esta razón, un diseño de camada cruz se emplea durante el procedimiento de estimulación táctil para asegurar que los cachorros están recibiendo experiencias similares en todos los demás dominios de desarrollo. Además, también es importante que múltiples crías de varias camadas, se seleccionan para el análisis para evitar la posibilidad de que los efectos son el resultado de un sesgo en una sola cría o arena.
Se cree que la estimulación táctil para imitar el comportamiento de la madre natural, lamiendo y aseo personal, que se cree que es beneficioso para el desarrollo de la descendencia. Aunque investigaciones anteriores han hecho hincapié en la primera semana de vida (P0-P7) es un período crítico para lamer y aseo 16, la magnitud del cambio se identificará según 18 días de tactile estimulación puede implicar que aunque existen momentos sensibles, la exposición ya es superior. También es importante tener en cuenta que los cachorros que recibieron estimulación táctil en este paradigma experimental también experimentan lamiendo y aseo por sus madres, por lo tanto, la estimulación táctil es en adición a la estimulación normal de administrado por la madre. Por último, también hay que ser conscientes de los cambios de región que dependen. Aunque la estimulación táctil durante el desarrollo de la mayor complejidad dendrítica en la corteza prefrontal, esto no garantiza que los cambios estructurales de esta naturaleza serán evidentes en todas las regiones del cerebro. Es posible que la morfología neuronal en otras regiones del cerebro tales como la corteza parietal, respondería de una manera notablemente diferente a la misma experiencia. Sin embargo, debido a que el procedimiento de estimulación táctil es fácil de administrar y no representa ningún riesgo para la descendencia o presas, tiene el potencial de servir como una herramienta valiosa para muchos estudios de investigación destinados a mejorar el desarrolloAl resultados.
Con respecto a la tinción de Golgi-Cox de tejido cerebral, los pasos críticos para la visualización con éxito de células neuronales son los siguientes: 1) debe existir una adecuada perfusión del cerebro con solución salina. Perfusión inadecuada o insuficiente de los resultados de tejido cerebral en los artefactos de los vasos sanguíneos que hacen que sea difícil de visualizar en realidad células neuronales a través del laberinto de los vasos sanguíneos, al tiempo que complica la capacidad de fotografiar las neuronas teñidas. 2) cerebros perfundidos se deben almacenar en solución de Golgi-Cox y solución de sacarosa en la oscuridad. Almacenamiento del tejido cerebral en la oscuridad reduce la tinción de fondo del tejido, incrementando de nuevo la oportunidad de visualizar con éxito las células neuronales de calidad. 3) El tejido cerebral se almacena en solución de sacarosa tras el almacenamiento de 14 días en solución de Golgi-Cox. Cuando el tejido se sumerge en la solución de sacarosa al 30% durante 2-5 días, los cerebros son más flexibles que impide rompiendo y el desgarro de las secciones cuandode corte. Es importante evitar que el tejido cerebral de que queda en la solución de sacarosa para el aumento de períodos de tiempo (a menos que la solución de sacarosa se sustituye continuamente con solución fresca) porque el almacenamiento prolongado en sacarosa reduce la calidad de la tinción. 4) Por último, una vez que las diapositivas han sido manchada y cubierta deslizado, se les debe dar suficiente tiempo para secarse antes de la visualización con un microscopio. Si no están permitidas las diapositivas para ventilar adecuadamente seco, el tejido puede oscurecerse, reduciendo la visualización satisfactoria de las neuronas corticales.
Se cree que los cambios estables en funcionamiento psicológico y las respuestas de comportamiento que se producen en respuesta a las experiencias para ser facilitado por la reorganización de la morfología neuronal y conectividad sináptica 17. Como estos cambios estructurales proporcionan un recurso medible para la plasticidad dependiente de la experiencia, el uso de un procedimiento de tinción fiable es importante. Procedimiento de tinción de Golgi-Cox basado Esta vibratome ofrece mancha fiableción de las ramas finas y las espinas dendríticas que pueden no ser evidentes con otros protocolos como celoidina-incrustación. El distintivo del procedimiento de Golgi-Cox se debe a su capacidad única para teñir una pequeña fracción de los elementos neuronales (1-10%), lo que permite el seguimiento de las neuronas individuales para las largas distancias. A pesar del hecho de que sólo una pequeña fracción de las neuronas están impregnadas con la tinción, las células que se representan visible, mantienen todas las características incluyendo cuerpo celular, dendritas, espinas dendríticas y axones. Por otra parte, cuando el procedimiento de tinción se lleva a cabo correctamente, las células teñidas se destacan con claridad y distinción sobre un fondo transparente, ya otras estructuras corticales permanecen sin teñir y transparente. Debido a la comprensión de que los cambios persistentes en funcionamiento hacia el exterior deben estar relacionados con la plasticidad del sistema nervioso, es decir, la capacidad de las neuronas para modificar su estructura y la conectividad, el procedimiento de tinción de Golgi-Cox proporciona a los investigadores unatécnica fiable para visualizar y cuantificar la plasticidad.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo está financiado por becas NSERC a BK y RG. Los autores también desean agradecer a Kehe Xie y Russell Hosain por su experiencia tinción de Golgi-Cox.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Potassium Dichromate | Fisher | P188 | |
Mercuric Chloride | Fisher | M1561 | |
Potassium Chromate | Fisher | P220 | |
Ammonium Hydroxide | Fisher | A669-500 | |
Kodak Rapid Fix | Vistek | Kodak 146 4016 | |
EtOH-95 & Anhydrous | Commercial Alcohols | No Cat Numbers | All other Et-OH are dilutions |
Swiffers- Soft Feather-Like dusters | Safeway | Can be found at most grocery stores | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S-9378 | |
HemoDe | Electron Microscopy Sciences | 23410 | |
Permount | Fisher | Sp15 | |
Slides | VWR | 160004-365 | |
Coverslips | VWR | 062011-9 |