本論文では、ラットの子の触覚刺激および神経形態のその後ゴルジコックス染色のための手順を説明します。触覚刺激は、家庭用ダスターで子犬をなでることで周産期に投与され、肯定的な経験である。ゴルジCOX染色は全体のニューロンの可視化を可能にする信頼性のある手順です。
行動の長期的な変化を生成するには、経験は、神経細胞の形態やシナプス接続で安定な変更を生産しなければならない。触覚刺激は、模倣がなめるとラットでグルーミング母体正初期の経験である。この肯定的な経験にラットの子を公開すると、家庭用ダスターとして非常にアクセスの材料を用いて簡単かつコスト効率よく完了することができます。クロスごみのデザインを使用して、子犬はどちらか15分、周産期を通じて1日3回、なでたり邪魔されずに残されている。この正の初期の経験に関連する神経可塑変化を測定するために、脳組織のゴルジ – コックス染色が利用される。ゴルジ – コックス含浸ではなくセルの全てよりもニューロンの離散的な数を染色するという事実のために、ゴルジコックス溶液で齧歯類の脳の染色は、細胞体、樹状突起、軸索を含む全体の神経要素の可視化を可能にし、そして樹状突起棘。染色手順のISは、数日間にわたって実施し、研究者が細部に細心の注意を払うことが必要です。染色が完了したらしかし、脳全体に含浸されており、継続的な分析のために無期限に保存することができる。したがって、ゴルジコックス染色は経験依存可塑性を研究するための貴重な資源である。
このような周産期のストレス1,2、感覚遮断3、および薬物毒性4のような脳の成熟に悪影響を早期に経験の検査のために多く報告され、利用技術がありますが、中にプラスの経験の影響を検討するために採用非常に少ない方法論がありますこの期間。さておき、環境エンリッチメントから、触覚刺激が実証効果5と治療を強化するいくつかの脳の1である。触覚刺激をなめるとグルーミング、母親のラットの行動を模倣した皮膚に感覚刺激する方法である。正操作などの一般的な受け入れは、触覚刺激が未熟児や新生児ラット6の成熟を 改善していることを示す研究から生じる。また、Meaney研究室7での研究は、母親なめやグルーミング、より高いレベルの子孫における肯定的な成果にリンクされていることを実証した。 Tのおかげでヘセ正の影響、触覚刺激は、急速に、不安8の削 減脳損傷9月11日に関連するアウトカムの改善、薬物感12を減衰させることを目的とし、是正戦略へと進化。このように、触覚刺激が劇的に神経細胞の形態や発達中の脳のシナプス接続を再編成する実証済みの能力と正の初期の経験の促進のための貴重な技術である。
神経細胞の形態の変化を調べて定量化するためには、無傷のニューロンを可視化することが必要である。ゴルジコックス染色手順は、完全なニューロン13の少数の離散的な染色を提供し、1800年代後半に出版さカミーロゴルジの技術の変形である。手順は、ランダム性と再現性で神経細胞を染色に見えますが、一般的に大きな欠陥として引用されている、小さな含浸率は、CEを含め、全体の神経要素の可視化を可能にするLL体、樹状突起、樹状突起棘および軸索。同様に、ゴルジ溶液で所与の脳に含浸させるために必要な時間はまた、崩壊として引用されている。しかしながら、染色が完了すると、組織が無期限に保存することができ、顕微鏡でのニューロンの脳と視覚化の灌流の間の時間は21日未満で完了することができ、時間が不合理ではないことが指定されてい。また、プロトコルに若干の変更を加えて、ゴルジコックス染色は効果的に、すべての年齢の範囲からのげっ歯類の脳に含浸させるために使用することができます。構造的なレベルでの変化は、行動や心理的機能に永続的な変更にリンクされているように、ゴルジコックス染色技術は、神経可塑性を測定するための貴重なツールを研究者に提供します。
発達中の脳の明白な可塑性のために、それは初期の経験を含む実験手順は徹底的に見直され、試みは、すべての介入の変数をコントロールするために行われることが重要です。このため、クロス同腹仔設計は、開発の他のすべてのドメインに類似した経験を受けていることを保証するために触覚刺激手順の間に使用される。また、複数の同腹仔からの複数の効果が、単一の子犬またはリターの偏りに起因する可能性を避けるために、分析のために選択されていることも重要である。
触覚刺激をなめるおよび子孫開発に有益であると考えられている、毛づくろい、天然に存在する母性行動を模倣すると考えられている。先行研究は、人生の最初の週(P0〜P7)は16を舐めやグルーミングのための重要な時期であると強調しているが、変化の膨大な大きさは、TAの18日後に識別ctile刺激に敏感な時代が存在するが、より長い露出が優れていることを意味するものであります。それが故に、触覚刺激が母親に投与した正常な刺激に加えている、この実験的なパラダイムに触覚刺激を受けた子犬もなめるとその母親でグルーミング体験ことに注意することも重要である。最終的に、人はまた、この地域に依存した変化を認識しなければなりません。開発中に触覚刺激が前頭前皮質の樹枝状の複雑さを増加したが、これはこの種の構造変化は、すべての脳領域で明らかになることを保証するものではありません。それは、頭頂葉皮質のような他の脳領域におけるニューロンの形態は、同じ経験に著しく異なる様式で応答することが可能である。触覚刺激手順が容易に投与され、子孫又はダムへの危険性がされていないので、それは、開発の向上を目的とした多くの調査研究のための貴重なツールとして役立つ可能性を秘めているらは成果。
次のように脳組織のゴルジコックス染色に関しては、神経細胞の正常な可視化のための重要なステップは次のとおりです。1)生理食塩水で脳の十分な灌流がなければならない。また、染色されたニューロンを撮影する能力を複雑にするが、それは実際には困難な血管の迷路を通って神経細胞を可視化すること、血管アーチファクトの脳組織の結果の不適切または不十分な潅流。 2)灌流脳はゴルジコックスソリューション、暗所でのショ糖溶液中に保存されるべきである。暗闇の中で脳組織を格納すると、再び正常品質神経細胞を可視化する機会を増加させる、組織のバックグラウンド染色を減少させる。 3)脳組織ゴルジコックス溶液中で14日間保存後のショ糖溶液中に保存されている。組織は2-5日間、30%ショ糖溶液中に浸漬されると、脳はより柔軟である場合切片を粉砕および引き裂きを防止するカッティング。スクロース中の長期保管は、染色の質を低下させるので(スクロース溶液を連続的に新鮮な溶液と交換されていない場合)増大した期間のスクロース溶液中に残存するから脳組織を防止することが重要である。スライドが染色されており、カバーが滑ったら4)最後に、彼らは顕微鏡で可視化前に乾燥するのに十分な時間を与えられるべきである。スライドを十分に乾燥した空気に許可されていない場合、組織は、皮質ニューロンの正常な可視化を低減する、暗くすることができる。
経験に応答して生じる心理的機能および行動応答の安定した変化は、ニューロンの形態とシナプス接続17の再編成によって促進されると考えられている。これらの構造変化は、経験依存可塑性の測定可能なリソースを提供するように、信頼性の高い染色手順を使用することは重要です。このビブラベースゴルジコックス染色手順は、信頼性の汚れを提供このようなセロイジン埋め込みなどの他のプロトコルとの明らかでないかもしれない細かい枝や樹状突起棘のING。ゴルジコックス手順の特殊性は、長距離用の単一ニューロンの追跡を可能にする神経細胞要素(1-10%)のわずかな部分を染色する能力に由来する。ニューロンのごく一部のみが染色が含浸されているという事実にもかかわらず、可視化された細胞は、細胞体、樹状突起、樹状突起および軸索を含むすべての機能を維持する。染色手順が正しく実行されたときに、他の皮質構造が染色されていない透明なままのでまた、染色された細胞は、透明な背景に対して明確かつ明確に際立っている。外側に機能の持続的な変化は、神経系の可塑性に関連していなければならないという認識のために、ゴルジコックス染色手順は、と研究者を提供し、その構造との接続性を修正するために神経細胞の機能、すなわちこの可塑性を可視化し、定量化するための信頼性の高い技術である。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、BKとRGにNSERCの補助金によって賄われている。また、作者は彼らのゴルジコックス染色の専門知識のためにKehe謝とラッセルHosainに感謝したいと思います。
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Potassium Dichromate | Fisher | P188 | |
Mercuric Chloride | Fisher | M1561 | |
Potassium Chromate | Fisher | P220 | |
Ammonium Hydroxide | Fisher | A669-500 | |
Kodak Rapid Fix | Vistek | Kodak 146 4016 | |
EtOH-95 & Anhydrous | Commercial Alcohols | No Cat Numbers | All other Et-OH are dilutions |
Swiffers- Soft Feather-Like dusters | Safeway | Can be found at most grocery stores | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S-9378 | |
HemoDe | Electron Microscopy Sciences | 23410 | |
Permount | Fisher | Sp15 | |
Slides | VWR | 160004-365 | |
Coverslips | VWR | 062011-9 |