Questo documento descrive le procedure per la stimolazione tattile dei cuccioli di ratto e successiva colorazione Golgi-Cox della morfologia neuronale. Stimolazione tattile è un'esperienza positiva che viene somministrato nel periodo perinatale da accarezzare cuccioli con un piumino famiglia. Golgi-Cox colorazione è una procedura affidabile che consenta la visualizzazione di interi neuroni.
Per generare cambiamenti a lungo termine nel comportamento, esperienze devono essere producendo cambiamenti stabili nella morfologia neuronale e la connettività sinaptica. Stimolazione tattile è un'esperienza positiva presto che imita materna leccare e governare nel ratto. L'esposizione cuccioli di ratto a questa esperienza positiva può essere completato in modo semplice e conveniente, utilizzando materiali altamente accessibili, come uno spolverino famiglia. Utilizzando un disegno cross-figliata, cuccioli sono o accarezzati o lasciati indisturbati, per 15 minuti, tre volte al giorno per tutto il periodo perinatale. Per misurare i cambiamenti neuroplastici relativi a questa prima esperienza positiva, Golgi-Cox colorazione del tessuto cerebrale viene utilizzato. Per il fatto che Golgi-Cox impregnazione macchie un numero discreto di neuroni piuttosto che tutte le cellule, la colorazione del cervello roditore con soluzione Golgi-Cox permette la visualizzazione di interi elementi neuronali, compreso il corpo cellulare, dendriti, assoni, e spine dendritiche. La procedura di colorazione is svolto per diversi giorni e richiede che il ricercatore prestare molta attenzione ai dettagli. Tuttavia, una volta colorazione è completato, l'intero cervello è stato impregnato e può essere conservata indefinitamente analisi in corso. Pertanto, Golgi-Cox colorazione è una risorsa preziosa per lo studio della plasticità esperienza-dipendente.
Anche se ci sono molte tecniche riportate e utilizzate per l'esame delle prime esperienze negative sulla maturazione del cervello, come lo stress perinatale 1,2, deprivazione sensoriale 3, e la tossicità della droga 4, ci sono pochissime le metodologie impiegate per esaminare gli effetti di esperienze positive in questo periodo di tempo. A parte l'arricchimento ambientale, stimolazione tattile è uno dei pochi cervello migliorando trattamenti con effetti dimostrati 5. Stimolazione tattile è un metodo di stimolazione sensoriale per la pelle che simula il comportamento di ratto materno, leccare e governare. La sua accettazione generale come una manipolazione positiva nasce da studi che indicano che la stimolazione tattile migliorato la maturazione dei neonati prematuri e ratti neonati 6. Inoltre, la ricerca in laboratorio Meaney 7 ha dimostrato che alti livelli di leccare materna e governare sono legati a risultati positivi nella prole. A causa di tinfluenze positive ueste, stimolazione tattile rapidamente evoluto in una strategia correttiva volta a ridurre l'ansia 8, migliorando i risultati associati a lesioni cerebrali 9-11, e attenuando droga sensibilizzazione 12. Come tale, la stimolazione tattile è una tecnica utile per la promozione delle prime esperienze positive, con una comprovata capacità di riorganizzare radicalmente la morfologia neuronale e la connettività sinaptica del cervello in via di sviluppo.
Al fine di esaminare e quantificare i cambiamenti nella morfologia neuronale, è necessario visualizzare neuroni intatti. La procedura di colorazione Golgi-Cox è una modifica della tecnica di Golgi pubblicato alla fine del 1800 che fornisce colorazione discreta di un piccolo numero di neuroni completi 13. Anche se la procedura sembra macchiare i neuroni a caso e la riproducibilità è comunemente citato come difetto principale, la visualizzazione permessi piccolo tasso impregnazione del tutto l'elemento neuronale, tra cui cell corpi, dendriti, le spine dendritiche, e assoni. Allo stesso modo, il tempo necessario per impregnare un dato cervello con soluzione Golgi è anche stata citata come una caduta. Tuttavia, dato che una volta colorazione è tessuto completo può essere conservata indefinitamente, e il tempo tra perfusione del cervello e visualizzazione di neuroni con un microscopio può essere completato in meno di 21 giorni, il periodo di tempo non è irragionevole. Inoltre, con piccole modifiche al protocollo, Golgi-Cox colorazione può essere efficacemente utilizzato per impregnare cervello di roditori da tutte le fasce d'età. Come cambiamenti a livello strutturale sono stati collegati a modifiche permanenti alle funzioni comportamentali e psicologiche, la tecnica di pittura Golgi-Cox fornisce ai ricercatori un valido strumento per misurare la neuroplasticità.
A causa della plasticità palese del cervello di sviluppo, è importante che le procedure sperimentali di prime esperienze sono accuratamente esaminati e tentativi di controllare per tutte le variabili intervenienti. Per questo motivo, un disegno cucciolata croce è impiegato durante la procedura di stimolazione tattile per garantire che i cuccioli stanno ricevendo esperienze simili in tutti gli altri domini di sviluppo. Inoltre, è anche importante che più cuccioli da più cucciolate sono selezionate per analisi per evitare la possibilità che gli effetti derivano da una polarizzazione in un singolo cucciolo o lettiera.
Stimolazione tattile si crede di imitare il naturale comportamento materno, leccare e governare, che è pensato per essere utile allo sviluppo prole. Sebbene la ricerca precedente ha sottolineato la prima settimana di vita (P0-P7) per essere un periodo critico per leccare e governare 16, la vastità del cambiamento identificato secondo 18 giorni di tastimolazione ctile può implicare che, sebbene esistano periodi sensibili, l'esposizione è più superiore. E 'anche importante notare che i cuccioli ricevono stimolazione tattile in questo paradigma sperimentale sperimentano anche leccare e governare dalle loro madri, quindi la stimolazione tattile è in aggiunta al normale stimolazione somministrata dalla madre. Infine, bisogna anche essere consapevoli dei cambiamenti regione-dipendente. Sebbene la stimolazione tattile durante lo sviluppo è aumentata complessità dendritiche nella corteccia prefrontale, questo non garantisce che i cambiamenti strutturali di questa natura saranno evidenti in tutte le regioni del cervello. E 'possibile che la morfologia neuronale in altre regioni del cervello come la corteccia parietale, risponderebbe in maniera sorprendentemente diverso per la stessa esperienza. Tuttavia, poiché la procedura di stimolazione tattile è facilmente gestito e non presenta alcun rischio per la prole o dighe, ha il potenziale per servire come uno strumento prezioso per molti studi di ricerca volti a migliorare lo sviluppoal esiti.
Per quanto riguarda Golgi-Cox colorazione del tessuto cerebrale, i passaggi critici per la visualizzazione di successo di cellule neuronali sono i seguenti: 1) deve esserci un'adeguata perfusione del cervello con soluzione fisiologica. Perfusione improprio o insufficiente dei risultati di tessuto cerebrale in artefatti vasi sanguigni che rendono difficile effettivamente visualizzare cellule neuronali attraverso il labirinto dei vasi sanguigni, ma anche di complicare la possibilità di fotografare i neuroni colorati. 2) cervelli perfusi devono essere conservati in soluzione Golgi-Cox e soluzione di saccarosio al buio. Conservazione del tessuto cerebrale al buio riduce la colorazione di fondo del tessuto, aumentando ancora la possibilità di visualizzare con successo le cellule neuronali qualità. 3) Tessuto cerebrale è memorizzato nella soluzione di saccarosio in seguito alla di immagazzinamento 14 giornata soluzione Golgi-Cox. Quando il tessuto viene immerso nella soluzione di saccarosio al 30% per 2-5 giorni, i cervelli sono più flessibili che impedisce la rottura e strappo delle parti quandotaglio. È importante prevenire tessuto cerebrale rimanga nella soluzione di saccarosio di maggiori periodi di tempo (a meno che la soluzione di saccarosio è continuamente sostituito con soluzione fresca) perché conservazione prolungata in saccarosio riduce la qualità della colorazione. 4) Infine, una volta che i vetrini sono stati macchiati e la copertura scivolato, devono avere il tempo sufficiente per asciugare prima visualizzazione al microscopio. Se i vetrini non sono autorizzati a ventilare adeguatamente asciutto, il tessuto potrebbe scurirsi, riducendo la visualizzazione di successo dei neuroni corticali.
Cambiamenti stabili nel funzionamento psicologico e risposte comportamentali che si verificano in risposta alle esperienze sono ritenute essere facilitato dalla riorganizzazione della morfologia neuronale e connettività sinaptica 17. Poiché questi cambiamenti strutturali forniscono una risorsa misurabile per plasticità esperienza-dipendente, l'uso di una procedura di colorazione affidabile è importante. Basato Questo vibratome procedura di colorazione Golgi-Cox fornisce macchia affidabilezione di rami sottili e spine dendritiche che possono non essere evidenti con altri protocolli come celloidina-embedding. Il carattere distintivo della procedura di Golgi-Cox deriva dalla sua capacità di macchiare solo una piccola frazione di elementi neuronali (1-10%), che consenta di risalire singoli neuroni per lunghe distanze. Nonostante il fatto che solo una piccola frazione di neuroni sono impregnati con la macchia, cellule che sono resi visibili, mantengono tutte le funzioni, tra cui corpo cellulare, dendriti, spine dendritiche e assoni. Inoltre, quando la procedura di colorazione viene eseguita correttamente, le cellule colorate distinguono chiaramente e distintamente su uno sfondo trasparente perché altre strutture corticali rimangono senza macchia e trasparente. Grazie alla realizzazione che cambiamenti persistenti nel funzionamento passivo devono essere correlati alla plasticità del sistema nervoso, ossia la capacità dei neuroni di modificare la loro struttura e la connettività, la procedura di colorazione Golgi-Cox fornisce ai ricercatori untecnica affidabile per visualizzare e quantificare questa plasticità.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è finanziato da sovvenzioni NSERC a BK e RG. Gli autori desiderano inoltre ringraziare Kehe Xie e Russell Hosain per la loro competenza colorazione Golgi-Cox.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Potassium Dichromate | Fisher | P188 | |
Mercuric Chloride | Fisher | M1561 | |
Potassium Chromate | Fisher | P220 | |
Ammonium Hydroxide | Fisher | A669-500 | |
Kodak Rapid Fix | Vistek | Kodak 146 4016 | |
EtOH-95 & Anhydrous | Commercial Alcohols | No Cat Numbers | All other Et-OH are dilutions |
Swiffers- Soft Feather-Like dusters | Safeway | Can be found at most grocery stores | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S-9378 | |
HemoDe | Electron Microscopy Sciences | 23410 | |
Permount | Fisher | Sp15 | |
Slides | VWR | 160004-365 | |
Coverslips | VWR | 062011-9 |