Ce document décrit les procédures de stimulation tactile de ratons et après coloration de Golgi-Cox de la morphologie neuronale. La stimulation tactile est une expérience positive qui est administré dans la période périnatale par caresser les petits avec un chiffon de ménage. Golgi-cox coloration est une procédure fiable permettant la visualisation des neurones entiers.
Pour générer des changements à long terme dans le comportement, les expériences doivent produire des changements stables dans la morphologie neuronale et la connectivité synaptique. La stimulation tactile est une première expérience positive qui imite maternels lécher et toilettage chez le rat. Exposer ratons à cette expérience positive peut être complété facilement et à moindre coût en utilisant des matériaux très accessibles, comme un chiffon de ménage. L'utilisation d'un dessin de la croix-portée, les chiots sont soit caressé ou laissés au repos, pendant 15 minutes, trois fois par jour pendant la période périnatale. Pour mesurer les changements neuroplastiques liés à cette première expérience positive Golgi-Cox coloration des tissus du cerveau est utilisée. En raison du fait que l'appareil de Golgi-Cox imprégnation colore un nombre discret de neurones et non la totalité des cellules, la coloration du cerveau de rongeurs avec une solution Golgi-Cox permet la visualisation d'éléments neuronaux entiers, y compris le corps de la cellule, des dendrites, les axones, et épines dendritiques. Le protocole de coloration is effectuée sur plusieurs jours et exige que le chercheur accorder une attention particulière aux détails. Cependant, une fois que la coloration est terminée, l'ensemble du cerveau a été imprégnée et peut être conservé indéfiniment à l'analyse en cours. Par conséquent, l'appareil de Golgi-Cox coloration est une ressource précieuse pour l'étude de l'expérience la plasticité.
Bien qu'il existe de nombreuses techniques rapportés et utilisés pour l'examen des premières expériences négatives sur la maturation du cerveau, comme le stress périnatal 1,2, la privation sensorielle 3, et 4 drogue toxicité, il existe très peu de méthodes employées pour examiner les effets des expériences positives dans cette période de temps. Mis à part l'enrichissement de l'environnement, la stimulation tactile est l'un des rares cerveau amélioration des traitements avec des effets démontrés 5. La stimulation tactile est une méthode de stimulation sensorielle à la peau qui imite le comportement de rat maternelle, léchage et toilettage. Son acceptation générale comme une manipulation positif découle des études indiquant que la stimulation tactile amélioré la maturation des prématurés et des rats nouveau-nés 6. En outre, la recherche dans le laboratoire Meaney 7 a démontré que des niveaux plus élevés de léchage et toilettage maternelle sont liés à des résultats positifs dans la progéniture. En raison de tinfluences positives es, stimulation tactile évolué rapidement dans une stratégie de redressement visant à réduire l'anxiété 8, l'amélioration des résultats liés à une lésion cérébrale 9-11, et atténuer médicament sensibilisation 12. En tant que tel, la stimulation tactile est une technique utile pour la promotion de premières expériences positives, avec une capacité éprouvée à réorganiser radicalement la morphologie neuronale et la connectivité synaptique du cerveau en développement.
Afin d'étudier et de quantifier les modifications de la morphologie neuronale, il est nécessaire pour visualiser les neurones intacts. La procédure de coloration de Golgi-Cox est une modification de la technique de Camillo Golgi publié dans les années 1800 qui fournit la coloration discrète d'un petit nombre de neurones complètes 13. Bien que la procédure semble tacher neurones au hasard et la reproductibilité est souvent cité comme défaut majeur, le permis de taux d'imprégnation petite visualisation de l'ensemble de l'élément neuronal, y compris CEorganes ll, dendrites, épines dendritiques, et des axones. De même, le temps nécessaire pour imprégner un cerveau donné avec une solution de Golgi a également été citée comme une chute. Toutefois, étant donné qu'une fois que la coloration est un tissu complet peut être conservée indéfiniment, et le temps entre la perfusion du cerveau et de la visualisation de neurones avec un microscope peut être achevée en moins de 21 jours, la période de temps n'est pas déraisonnable. En outre, avec des modifications mineures au protocole, Golgi-Cox coloration peut être efficacement utilisée pour imprégner le cerveau de rongeurs de toutes les tranches d'âge. Comme les changements au niveau de la structure ont été liés à des modifications persistantes de fonctionnement comportemental et psychologique, la technique de coloration de Golgi-Cox offre aux chercheurs un outil précieux pour mesurer la neuroplasticité.
En raison de la plasticité manifeste du cerveau en développement, il est important que les procédures expérimentales portant sur les premières expériences sont soigneusement examinés et des tentatives sont faites pour contrôler toutes les variables qui interviennent. Pour cette raison, une conception de la litière croix est utilisé lors de la procédure de stimulation tactile de veiller à ce que les chiots reçoivent des expériences similaires dans tous les autres domaines du développement. En outre, il est également important que de multiples petits de plusieurs portées sont sélectionnées pour analyse afin d'éviter la possibilité que les effets résultent d'une polarisation dans un seul petit ou litière.
La stimulation tactile est censé imiter le comportement de la mère naturelle, léchage et toilettage, qui est considéré comme bénéfique pour le développement de la progéniture. Bien que des études antérieures ont mis l'accent sur la première semaine de vie (P0-P7) est une période critique pour lécher et toilettage 16, l'ampleur du changement identifié suite à 18 jours de tactile stimulation peut signifier que, bien que les périodes sensibles existent, plus l'exposition est supérieure. Il est également important de noter que les chiots reçoivent une stimulation tactile dans ce paradigme expérimental connaissent aussi lécher et le toilettage de leur mère, d'où la stimulation tactile est en plus à la stimulation normale administré par la mère. Enfin, il faut aussi être conscient des changements de région dépendant. Bien que la stimulation tactile au cours du développement a augmenté la complexité dendritique dans le cortex préfrontal, cela ne garantit pas que les changements structurels de cette nature seront évidents dans toutes les régions du cerveau. Il est possible que la morphologie neuronale dans d'autres régions du cerveau telles que le cortex pariétal, réagirait de façon remarquablement différentes de la même expérience. Cependant, parce que la procédure de stimulation tactile est facile à administrer et ne pose aucun risque pour la descendance ou des barrages, il a le potentiel de servir comme un outil précieux pour de nombreuses études de recherche visant à améliorer le développementrésultats al.
En ce qui concerne l'appareil de Golgi-Cox coloration du tissu cérébral, les étapes critiques pour la réussite de la visualisation des cellules neuronales sont les suivantes: 1) il doit y avoir une perfusion adéquate du cerveau avec une solution saline. Perfusion inadéquate ou insuffisante des résultats de tissu cérébral dans les artefacts des vaisseaux sanguins qui font qu'il est difficile de réellement visualiser les cellules neuronales dans le dédale des vaisseaux sanguins, tout en compliquant la possibilité de photographier les neurones colorés. 2) cerveaux perfusés doivent être stockés dans une solution de Golgi-Cox et solution de saccharose dans l'obscurité. Stocker le tissu cérébral dans l'obscurité réduit la coloration du tissu de fond, augmentant encore le risque de visualisation avec succès des cellules neuronales de qualité. 3) Le tissu cérébral est stocké dans une solution de saccharose suivant l'entreposage de 14 jours dans une solution de Golgi-Cox. Lorsque le tissu est immergé dans la solution de saccharose à 30% pendant 2-5 jours, les cerveaux sont plus souples qui empêche éclatement et la déchirure des sections oùcoupe. Il est important d'empêcher le tissu cérébral de rester dans la solution de saccharose pour des périodes de temps accrues (à moins que la solution de saccharose est continuellement remplacée par une solution fraîche) en raison d'un stockage prolongé en saccharose réduit la qualité de la coloration. 4) Enfin, une fois les lames ont été colorées et couvercle glissé, ils devraient être suffisamment de temps pour sécher avant de visualisation au microscope. Si les lames ne sont pas autorisés à diffuser suffisamment sec, le tissu peut s'assombrir, réduisant visualisation succès de neurones corticaux.
Des changements stables dans le fonctionnement psychologique et des réponses comportementales qui se produisent en réponse à des expériences sont soupçonnés d'être facilitée par la réorganisation de la morphologie neuronale et la connectivité synaptique 17. Comme ces changements structurels constituent une ressource mesurable pour l'expérience la plasticité, l'utilisation d'une procédure de coloration fiable est important. Cette base vibratome Golgi-Cox procédure de coloration fournit tache fiabletion de fines branches et les épines dendritiques qui peuvent ne pas être évident avec d'autres protocoles tels que celloïdine-encastrement. La particularité de la procédure de Golgi-Cox vient de sa capacité à colorer seulement une petite fraction d'éléments neuronaux (1-10%), de ce qui permet le traçage des neurones individuels pour les longues distances. En dépit du fait que seule une petite fraction des neurones sont imprégnés avec le colorant, les cellules qui sont rendues visibles, à maintenir toutes les fonctions, y compris le corps de la cellule, des dendrites, épines dendritiques et des axones. En outre, lorsque la procédure de coloration est effectuée correctement, les cellules colorées se distinguent clairement et distinctement sur un fond transparent parce que d'autres structures corticales restent non colorées et transparent. En raison de la prise de conscience que les modifications persistantes dans le fonctionnement vers l'extérieur doit être lié à la plasticité du système nerveux, à savoir la capacité des neurones à modifier leur structure et leur connectivité, la procédure de coloration de Golgi-Cox donne aux chercheurs untechnique fiable de visualiser et de quantifier cette plasticité.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail est financé par des subventions du CRSNG à BK et RG. Les auteurs tiennent aussi à remercier Kehe Xie et Russell Hosain pour leur expertise en matière de coloration de Golgi-Cox.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Potassium Dichromate | Fisher | P188 | |
Mercuric Chloride | Fisher | M1561 | |
Potassium Chromate | Fisher | P220 | |
Ammonium Hydroxide | Fisher | A669-500 | |
Kodak Rapid Fix | Vistek | Kodak 146 4016 | |
EtOH-95 & Anhydrous | Commercial Alcohols | No Cat Numbers | All other Et-OH are dilutions |
Swiffers- Soft Feather-Like dusters | Safeway | Can be found at most grocery stores | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S-9378 | |
HemoDe | Electron Microscopy Sciences | 23410 | |
Permount | Fisher | Sp15 | |
Slides | VWR | 160004-365 | |
Coverslips | VWR | 062011-9 |