وتصف هذه الورقة إجراءات التحفيز عن طريق اللمس من الفئران الوليدة واللاحقة تلطيخ جولجي كوكس مورفولوجيا الخلايا العصبية. التحفيز عن طريق اللمس هي تجربة الإيجابية التي تدار في فترة ما حول الولادة بواسطة التمسيد الجراء مع منفضة المنزلية. جولجي كوكس تلطيخ هو إجراء موثوق يسمح التصور من الخلايا العصبية بأكملها.
لتوليد التغييرات على المدى الطويل في السلوك والخبرات يجب أن تنتج تغييرات مستقرة في مورفولوجيا الخلايا العصبية واتصال متشابك. التحفيز عن طريق اللمس هو تجربة إيجابية في وقت مبكر أن يقلد الأم لعق والاستمالة في الفئران. تعريض الفئران الوليدة لهذه التجربة الإيجابية يمكن أن تكتمل بسهولة وفعالية من حيث التكلفة عن طريق استخدام مواد للوصول للغاية مثل خرقة المنزلية. باستخدام تصميم عبر القمامة، والجراء إما القوية أو اليسار دون عائق، لمدة 15 دقيقة، ثلاث مرات في اليوم الواحد طوال فترة ما حول الولادة. لقياس التغيرات المرونة العصبية المرتبطة بهذا تجربة إيجابية في وقت مبكر، ويستخدم جولجي كوكس تلطيخ من أنسجة المخ. نظرا لحقيقة أن جولجي كوكس التشريب البقع عدد محدد من الخلايا العصبية بدلا من كافة الخلايا، وتلطيخ من الدماغ القوارض مع حل جولجي كوكس يسمح التصور من عناصر الخلايا العصبية بأكملها، بما في ذلك خلايا الجسم، التشعبات، المحاور، و العمود الفقري شجيري. الإجراء ط تلطيخقامت ليالي على مدى عدة أيام، ويتطلب أن الباحث إيلاء اهتمام وثيق للتفاصيل. ومع ذلك، بمجرد الانتهاء من التلوين، وقد مشربة الدماغ بأكمله، ويمكن الحفاظ عليها لأجل غير مسمى لتحليل الجارية. وبالتالي، جولجي كوكس تلطيخ هو مصدرا قيما لدراسة تعتمد على الخبرة اللدونة.
على الرغم من أن هناك العديد من التقنيات وذكرت والاستفادة منها للفحص في وقت مبكر من الخبرات السلبية على نضوج الدماغ، مثل الإجهاد في الفترة المحيطة بالولادة 1،2، 3 الحرمان الحسي، وسمية الدواء 4، وهناك عدد قليل جدا من المنهجيات المستخدمة لدراسة آثار التجارب الإيجابية في هذه الفترة الزمنية. وبصرف النظر عن تخصيب البيئية، وتحفيز اللمس هي واحدة من عدد قليل من الدماغ تعزيز العلاج مع تأثيرات أظهرت 5. التحفيز عن طريق اللمس هو طريقة التحفيز الحسي على الجلد الذي يحاكي سلوك الفئران الأمهات، ولعق الاستمالة. القبول العام بوصفها التلاعب إيجابية ينشأ من الدراسات تشير إلى أن التحفيز عن طريق اللمس المحسنة نضوج الأطفال الخدج حديثي الولادة والجرذان 6. بالإضافة إلى ذلك، وقد أثبتت الأبحاث في المختبر ل Meaney 7 أن مستويات أعلى من لعق الأمهات والاستمالة ترتبط نتائج إيجابية في النسل. بسبب رالتأثيرات الإيجابية ذات المناظر، والتحفيز عن طريق اللمس تطورت بسرعة إلى استراتيجية علاجية تهدف إلى الحد من القلق 8، وتحسين النتائج المرتبطة إصابات الدماغ 9-11، وتخفيف توعية المخدرات 12. على هذا النحو، والتحفيز عن طريق اللمس هو أسلوب قيمة لتعزيز الخبرات الإيجابية في وقت مبكر، مع القدرة ثبت لإعادة تنظيم بشكل كبير مورفولوجيا الخلايا العصبية واتصال متشابك من الدماغ النامية.
من أجل دراسة وقياس التغيرات في التشكل العصبية، فمن الضروري لتصور الخلايا العصبية سليمة. الإجراء تلطيخ جولجي كوكس هو تعديل لتقنية كاميلو غولجي نشرت في أواخر 1800s يوفر تلطيخ منفصلة من عدد صغير من الخلايا العصبية كاملة 13. على الرغم من أن الإجراء يبدو أن وصمة عار الخلايا العصبية عشوائيا واستشهد استنساخ باسم خللا رئيسيا، والتصور تصاريح معدل التبويض صغيرة من العنصر العصبية بأكملها، بما في ذلك مالهيئات ليرة لبنانية، التشعبات، العمود الفقري شجيري، ومحاور عصبية. وبالمثل، فإن الوقت المطلوب لتلقيح الدماغ تعطى مع حل جولجي كما تم الاستشهاد باعتباره سقوط. ومع ذلك، نظرا لأنه بمجرد تلطيخ هو يمكن الحفاظ الأنسجة كاملة إلى أجل غير مسمى، والوقت بين التروية للدماغ والتصور من الخلايا العصبية مع المجهر يمكن أن تكتمل في أقل من 21 يوما، والفترة الزمنية ليست غير معقولة. بالإضافة إلى ذلك، مع تعديلات طفيفة على بروتوكول، جولجي كوكس تلطيخ يمكن استخدامها بشكل فعال في تلقيح أدمغة القوارض من جميع الفئات العمرية. كما تم ربط التغيرات في المستوى الهيكلي للتعديلات المستمرة لسير السلوكية والنفسية، وتوفر هذه التقنية تلطيخ جولجي كوكس الباحثين مع أداة قيمة لقياس المرونة العصبية.
بسبب اللدونة العلني من الدماغ النامية، فمن المهم أن الإجراءات التجريبية التي تنطوي على خبرات مبكرة تتم مراجعة شاملة وتبذل محاولات للسيطرة على جميع المتغيرات المتدخلة. لهذا السبب، يعمل تصميم القمامة عبر أثناء إجراء التحفيز عن طريق اللمس لضمان أن الجراء يتلقون تجارب مماثلة في كافة المجالات الأخرى للتنمية. بالإضافة إلى ذلك، فإنه من المهم أيضا أن يتم اختيار الجراء متعددة من الفضلات متعددة للتحليل لتجنب احتمال أن الآثار الناتجة عن وجود تحيز في الجرو واحد أو القمامة.
ويعتقد التحفيز عن طريق اللمس لتقليد سلوك الأمهات التي تحدث بشكل طبيعي، ولعق الاستمالة، والتي يعتقد أن تكون مفيدة لتطوير النسل. على الرغم من أن أكدت الأبحاث قبل الأسبوع الأول من الحياة (P0-P7) أن تكون فترة حرجة للعق والاستمالة 16، وضخامة التغيير المحددة التالية 18 يوما من تاالتحفيز ctile قد يعني أنه على الرغم من وجود الاوقات الحساسة، والتعرض يعد هو الافضل. من المهم أيضا أن نلاحظ أن الجراء تلقي التحفيز عن طريق اللمس في هذا النموذج التجريبي أيضا تجربة لعق والاستمالة من قبل أمهاتهم، وبالتالي تحفيز اللمس بالإضافة إلى التحفيز الطبيعي تدار من قبل الأم. أخيرا، يجب على المرء أيضا أن يكون مدركا للتغيرات التي تعتمد على المنطقة. على الرغم من التحفيز عن طريق اللمس أثناء تطوير زيادة التعقيد شجيري في قشرة الفص الجبهي، وهذا لا يضمن أن التغييرات الهيكلية من هذا النوع سوف يكون واضحا في جميع مناطق الدماغ. فمن الممكن أن مورفولوجيا الخلايا العصبية في مناطق الدماغ الأخرى مثل القشرة الجدارية، سترد بطريقة مختلفة لافت للنظر لنفس التجربة. ومع ذلك، لأن الإجراء التحفيز عن طريق اللمس تدار بسهولة ولا تشكل أي خطر على ذرية أو السدود، فمن لديه القدرة ليكون بمثابة أداة قيمة بالنسبة للعديد من البحوث والدراسات التي تهدف إلى تحسين التنميةآل النتائج.
فيما يتعلق جولجي كوكس تلطيخ من أنسجة المخ، والخطوات الحاسمة لتصور الخلايا العصبية الناجحة هي كما يلي: 1) يجب أن يكون هناك التروية الكافية للدماغ مع محلول ملحي. نضح غير لائق أو غير كافية من النتائج أنسجة المخ في التحف الأوعية الدموية التي تجعل من الصعب فعلا تصور الخلايا العصبية من خلال متاهة من الأوعية الدموية، في حين يعقد أيضا القدرة على تصوير الخلايا العصبية الملون. 2) يجب أن يتم تخزينها في أدمغة Perfused جولجي كوكس الحل والحل السكروز في الظلام. تخزين أنسجة المخ في الظلام يقلل من تلوين الخلفية من الأنسجة، وزيادة مرة أخرى فرصة لتصور الخلايا العصبية بنجاح الجودة. 3) يتم تخزينها في أنسجة الدماغ حل السكروز بعد 14 يوم تخزين في حل جولجي كوكس. عندما يتم غمر النسيج في محلول السكروز 30٪ لمدة 2-5 أيام، والعقول هي أكثر مرونة مما يمنع تحطيم وتمزيق أقسام عندماالقطع. من المهم لمنع أنسجة المخ من المتبقية في حل السكروز لزيادة الفترات الزمنية (ما لم يتم استبدال حل السكروز باستمرار مع حل جديد) بسبب التخزين لفترات طويلة في السكروز يقلل من جودة تلطيخ. 4) وأخيرا، بمجرد ملطخة الشرائح وتراجع الغطاء، ينبغي أن تعطى الوقت الكافي لتجف قبل التصور مع المجهر. إذا لم يتم السماح الشرائح في الهواء الجاف على نحو كاف، والأنسجة قد تلقي بظلالها، والحد من التصور ناجح من الخلايا العصبية القشرية.
ويعتقد أن التغييرات استقرارا في الأداء النفسي والاستجابات السلوكية التي تحدث استجابة لخبرات لأن تيسره إعادة تنظيم مورفولوجيا الخلايا العصبية واتصال متشابك 17. كما توفر هذه التغييرات الهيكلية مورد قابلة للقياس تعتمد على الخبرة اللدونة، واستخدام إجراء تلطيخ موثوقة هو المهم. يوفر هذا الإجراء على أساس vibratome تلطيخ جولجي كوكس وصمة عار موثوقةفروع غرامة والعمود الفقري شجيري التي قد لا يكون واضحا مع البروتوكولات الأخرى مثل سيلويدين التضمين جي. تميز الإجراء جولجي كوكس ينبع من قدرتها على صمة عار سوى جزء صغير من عناصر الخلايا العصبية (1-10٪)، والذي يسمح بتعقب الخلايا العصبية واحد لمسافات طويلة. على الرغم من حقيقة أنه ليس هناك سوى جزء صغير من الخلايا العصبية والمشرب مع وصمة عار، والخلايا التي يتم تقديمها مرئية، والحفاظ على جميع الميزات بما في ذلك خلايا الجسم، التشعبات، العمود الفقري شجيري ومحاور عصبية. علاوة على ذلك، عند تنفيذ الإجراء تلطيخ خارج بشكل صحيح، فإن الخلايا الملون تبرز بوضوح وصراحة على خلفية شفافة لأن الهياكل القشرية الأخرى لا تزال غير ملوثين وشفافة. نظرا لإدراك أن التغيرات المستمرة في سير الخارج يجب أن تكون ذات صلة اللدونة من الجهاز العصبي، أي قدرة الخلايا العصبية لتعديل هيكلها والاتصال، ويوفر الإجراء تلطيخ جولجي كوكس الباحثين معتقنية يمكن الاعتماد عليها لتصور وقياس هذا اللدونة.
The authors have nothing to disclose.
ويتم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة NSERC إلى BK وRG. فإن الكتاب أود أيضا أن أشكر Kehe شيه وراسل Hosain الخاصة بهم جولجي كوكس الخبرة تلطيخ.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Potassium Dichromate | Fisher | P188 | |
Mercuric Chloride | Fisher | M1561 | |
Potassium Chromate | Fisher | P220 | |
Ammonium Hydroxide | Fisher | A669-500 | |
Kodak Rapid Fix | Vistek | Kodak 146 4016 | |
EtOH-95 & Anhydrous | Commercial Alcohols | No Cat Numbers | All other Et-OH are dilutions |
Swiffers- Soft Feather-Like dusters | Safeway | Can be found at most grocery stores | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S-9378 | |
HemoDe | Electron Microscopy Sciences | 23410 | |
Permount | Fisher | Sp15 | |
Slides | VWR | 160004-365 | |
Coverslips | VWR | 062011-9 |