Summary

Sistein Kalıntılarının Solvent Erişilebilirlik Analizi<em> Mısır rayado fino virüsü</emÜretilen> Virüs gibi parçacıklar<em> Nicotiana benthamiana</emVLP'ler için Peptidlerin> Bitkiler ve Çapraz bağlama

Published: February 14, 2013
doi:

Summary

Sistein artıkları tiyol grubunun çözücü yönelik analiz etmek için bir yöntem,<em> Mısır rayado fino virüsü</emBir peptid çapraz bağlama reaksiyonu, ardından> (MRFV)-virüs benzeri tanecikler (VLP'ler) tarif edilir. Yöntem, belirli reaksiyonlar için hedef olabilir VLP'ler yüzeyi üzerinde çeşitli kimyasal gruplarından durumu yararlanır.

Abstract

Virüs özellikleri ve fiziko-kimyasal ve fiziksel özelliklerini taklit ve sömürücü dünyanın en acil sorunlarından bazılarına çözümler sunmak için umut vaat ediyor. Sırf aralığı ve ilginç özellikleri ile birleştiğinde virüs tipleri potansiyel virüs tabanlı teknolojilerde uygulamalar için sonsuz fırsatlar verecektir. Virüsler, sıcaklık ve pH koşulları altında geniş bir yelpazede farklı şekil ve boyut, simetri özgüllüğü, polyvalence, ve sabit özelliklere sahip partiküller halinde kendini monte etmek özelliğine sahiptir. Doğal olarak, bu gibi özelliklerinin dikkate değer bir dizi ile, virüs biomateryaller 9, aşılar, 14, 15, elektronik maddeler, kimyasal araçlar, konteynırlar ve moleküler elektronik 4, 5, 10, 11, 16, 18, ​​12 olarak kullanım için önerilmiştir.

Nanoteknolojide virüsler kullanılması için, yeni işlevler vermek için kendi doğal formlardan değiştirilmesi gerekir. Bu zorlu process gen viral genomun değişiklik ve kimyasal olarak virüs parçacığı reaktif gruplar 8 ile yabancı ya da arzu edilen moleküllerin bağlanması dahil çeşitli mekanizmalar vasıtasıyla gerçekleştirilebilir. Bir virüs değiştirme yeteneği öncelikle virüs fizikokimyasal ve fiziksel özelliklerine bağlıdır. Buna ek olarak, genetik veya fizikokimyasal olumsuz değişiklikler virüsün doğal yapısını ve fonksiyonunu etkileyen virüs olmadan gerçekleştirilmesi gerekir. Maize rayado fino virüsü (MRFV) kat proteinler, protein-protein stabilize edilmektedir kararlı ve boş VLP'ler üreten E. coli içinde kendi kendine bir araya etkileşimi ve bu virüs bazlı teknolojileri uygulamalar 8 kullanılabilir. Tütün bitkilerinde üretilen peptidlerin VLP'ler çeşitli kovalent 13 görüntülenebilir hangi bir yapı iskelesi olarak incelenmiştir. Burada, bir virüs kapsid içinde çözücü erişilebilir sissteinler hangi modifikasyonu için kullanılabilir belirlemek) 1 adımları açıklarkatyon, ve 2) capsids ile değiştirilmiş peptitler bioconjugate. Doğal ya da mutationally takılan amino asit kalıntıları ve standart bağlama teknolojileri kullanarak, malzemeler çok çeşitli böyle Brom mozaik virüsü 3, karanfil benek virüsü 12, Börülce klorotik benek virüsü 6, Tütün mozaik virüsü gibi bitki yüzeyinde ortaya konulmuştur Virüs 17, Şalgam sarı mozaik virüsü 1 ve MRFV 13.

Protocol

1. Nicotiana benthamiana Bitkiler Virüs Aşılaması ve VLP'ler Arıtma Patates X virüsü (PVX) tabanlı taşıyan vektör plasmidlerden şapkalı T7 RNA transkriptleri üretin MRFV wild-tip (wt) ve Cys-mutasyona uğramış kılıf protein (CP) genleri 12, Ambion en T7-mMessage mMachine Kit kullanarak. Her T7 transkript reaksiyon için, N., iki tam genişletilmiş yaprakları aşılamak 10 ul reaksiyon ile ve 25 ışık (25,000-30,000 lux) ile 16 …

Representative Results

N. mutant MRFV kılıf protein (CP) genlerin geçici ifadesi bir PVX bazlı vektör üretiminde VLP'ler içinde benthamiana bitki Şekil 1 'de tarif edilmektedir. Modifiye MRFV kılıf protein geni bir PVX tabanlı vektör, pP2C2S 2, (D. Baulcombe, Sainsbury Laboratuvarları, Norwich, İngiltere bir hediye) olarak çoğaltılamaz subgenomik CP organizatörü transkripsiyonel kontrolü altında amplifiye ve sonra yerleştirilir. Yılında In vitro RNA transkr…

Discussion

Burada sunulan yöntem, bitki üretilen VLP'ler yüzeyi üzerinde hem de diğer protein kompleksleri üzerinde mevcut reaktif sistein çok hassas ve hızlı bir analizine izin verir. Maleimides stabil tiyoeter bağları oluşturmak için ücretsiz sülfidril içeren moleküllerle reaksiyona tiyol özgü reaktifler vardır. Bu yöntem, diğer amino asitler ile etkileşimlerine sülfhidril grupları ile tepkimeye maleimides özgüllüğünü dayanmaktadır. VLP'ler arasında doğal yapısının korunması tüm sü…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments
Thinwall, Ultra-Clear Tubes Beckman 344059  
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Life Tecnologies AM1344M  
Fluorescein-5-Maleimide Thermo Scientific Life Technologies 46130 F150 46130 is out of order substitute with F150
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific 28005  
EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format Thermo Scientific 21901  
SM(PEG)n Crosslinkers Thermo Scientific 22107  
10-20% Tris-Glycine gel Invitrogen EC61352  
Laemmli Buffer Bio-Rad 1610737  
Tris Glycine SDS Running Buffer Invitrogen LC2675  
Tris Glycine Transfer Buffer Invitrogen LC3675  
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich Invitrogen LC2001  
Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG Kirkegaard and Perry Laboratories 0751516  
NBT/BCIP Phosphatase Substrate Kirkegaard and Perry Laboratories 508107  

References

  1. Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
  2. Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2, 549-557 (1992).
  3. Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. Packaging of gold particles in viral capsids. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).
  4. Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles. Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).
  5. Gazit, E. Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS. J. 274, 317-322 (2007).
  6. Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation. Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).
  7. Hammond, R. W., Hammond, J. Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli. Virus Res. 147, 208-215 (2010).
  8. Hermamson, G. T. . Bioconjugate techniques. , (1991).
  9. Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo. Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).
  10. Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires. Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).
  11. Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate. J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).
  12. Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus. Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).
  13. Natilla, A., Hammond, R. W. Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display. J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).
  14. Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route. Virology. 343, 2224-2235 (2005).
  15. Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus. Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).
  16. Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus. J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).
  17. Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
  18. Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).

Play Video

Cite This Article
Natilla, A., Hammond, R. W. Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs. J. Vis. Exp. (72), e50084, doi:10.3791/50084 (2013).

View Video