Summary

Анализ растворителей доступность остатков цистеина на<em> Кукуруза rayado Fino вирус</em> Вирус типа частиц, образующихся в<em> Nicotiana benthamiana</em> Растения и Перекрестное связывание пептидов VLPs

Published: February 14, 2013
doi:

Summary

Метод анализа растворителей доступность тиоловые группы остатков цистеина в<em> Кукуруза rayado Fino вирус</em> (MRFV)-вирус типа частиц (VLP), а затем пептида реакции сшивания описано. Метод использует преимущества наличия нескольких химических групп на поверхности ВПЧ, которые могут стать мишенью для конкретной реакции.

Abstract

Имитация и эксплуатации вирус свойства и физико-химические и физические характеристики держит обещание дать ответы на некоторые из наиболее актуальных проблем в мире. Сам диапазон и типы вирусов в сочетании с их интригующими свойствами потенциально дают бесконечные возможности для применения в вирус-технологий. Вирусы имеют возможность самостоятельно собираться в частицы с дискретной формы и размера, специфики симметрии, поливалентности и стабильные свойства в широком диапазоне температур и рН условиях. Не удивительно, что с таким замечательным набором свойств, вирусы предложены для использования в биоматериалов 9, вакцины 14, 15, электронных материалов, химических средств и молекулярных электронных контейнеров 4, 5, 10, 11, 16, 18, ​​12.

Для того чтобы использовать вирусы в области нанотехнологий, они должны быть изменены с их естественной формы, чтобы придать новые функции. В этом сложном пр.ocess может осуществляться посредством нескольких механизмов, включая генетические модификации вирусного генома и химически крепления иностранной или желаемой молекулы вирусной частицы реактивные группы 8. Возможность изменять вирус в первую очередь зависит от физико-химических и физических свойств вируса. Кроме того, генетические или физико-химические изменения должны быть выполнены без ущерба для нативной структуры вируса и вируса функции. Кукурузы rayado Fino вируса (MRFV) белков пальто самостоятельно собираться в кишечной палочки получения стабильных и пустые ВПЧ, которые стабилизировать белок-белковых взаимодействий и которые могут быть использованы в вирусных технологий на основе применения 8. VLPs производится в растениях табака были рассмотрены как эшафот, на котором различные пептиды могут быть ковалентно отображается 13. Здесь мы описываем шаги: 1) определить, какие из доступных растворителей цистеина в капсид вируса доступны для модификацийкатионов, и 2) Bioconjugate пептидов изменение капсид. С помощью родных или мутационно вставлен аминокислотных остатков и стандартных технологий связи, широкий спектр материалов были выставлены на поверхности вирусов растений, таких как, Brome вируса мозаики 3, гвоздика пятнистости вируса 12, Вигну хлоротичных пятнистости вирус 6, табачной мозаики Вирус 17, репа вирус желтой мозаики 1, и MRFV 13.

Protocol

1. Прививка Вирус ВПЧ и очистки от растений Nicotiana benthamiana Продукция ограничен T7-РНК-транскрипты из картофельного вируса X (PVX)-плазмиды на основе вектора, несущего MRFV дикого типа (WT) и Cys-мутировал белка оболочки (CP) генов 12, с использованием Ambion в T7-mMessage mMachine Kit. Для к…

Representative Results

Переходный выражение мутантного белка оболочки MRFV (CP) генов в N. benthamiana растений в PVX-вектора на основе производства VLP, представлена ​​на рисунке 1. Изменения пальто MRFV гена белка усиливается с помощью ПЦР, а затем помещен под транскрипционный контроль дублируется промоут?…

Discussion

Метод, представленный здесь, дает очень чувствительный и быстрый анализ реактивных цистеина, присутствующего на поверхности растений производства VLP, а также на других белковых комплексов. Малеимиды являются тиол-специфических реагентов, которые вступают в реакцию с свободных сульфг…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments
Thinwall, Ultra-Clear Tubes Beckman 344059  
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Life Tecnologies AM1344M  
Fluorescein-5-Maleimide Thermo Scientific Life Technologies 46130 F150 46130 is out of order substitute with F150
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific 28005  
EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format Thermo Scientific 21901  
SM(PEG)n Crosslinkers Thermo Scientific 22107  
10-20% Tris-Glycine gel Invitrogen EC61352  
Laemmli Buffer Bio-Rad 1610737  
Tris Glycine SDS Running Buffer Invitrogen LC2675  
Tris Glycine Transfer Buffer Invitrogen LC3675  
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich Invitrogen LC2001  
Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG Kirkegaard and Perry Laboratories 0751516  
NBT/BCIP Phosphatase Substrate Kirkegaard and Perry Laboratories 508107  

References

  1. Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
  2. Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2, 549-557 (1992).
  3. Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. Packaging of gold particles in viral capsids. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).
  4. Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles. Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).
  5. Gazit, E. Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS. J. 274, 317-322 (2007).
  6. Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation. Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).
  7. Hammond, R. W., Hammond, J. Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli. Virus Res. 147, 208-215 (2010).
  8. Hermamson, G. T. . Bioconjugate techniques. , (1991).
  9. Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo. Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).
  10. Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires. Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).
  11. Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate. J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).
  12. Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus. Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).
  13. Natilla, A., Hammond, R. W. Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display. J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).
  14. Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route. Virology. 343, 2224-2235 (2005).
  15. Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus. Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).
  16. Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus. J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).
  17. Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
  18. Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).

Play Video

Cite This Article
Natilla, A., Hammond, R. W. Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs. J. Vis. Exp. (72), e50084, doi:10.3791/50084 (2013).

View Video