Summary

تحليل إمكانية الوصول المذيبات من بقايا السيستين على<em> الذرة rayado فينو فيروس</em> الفيروسات مثل الجزيئات التي تنتج في<em> نيكوتيانا benthamiana</em> النباتات والصليب ربط-من الببتيدات لVLPs

Published: February 14, 2013
doi:

Summary

وهناك طريقة لتحليل إمكانية وصول المذيب للمجموعة ثيول من بقايا السيستين من<em> الذرة rayado فينو فيروس</emيوصف> (MRFV)-الفيروسات مثل الجزيئات (VLPs)، يليه رد فعل عبر ربط الببتيد. الأسلوب يستفيد من توافر عدة مجموعات كيميائية على سطح VLPs التي يمكن أن تكون أهدافا لردود فعل معينة.

Abstract

محاكاة واستغلال الخصائص الفيزيائية والخصائص الفيروس والبدنية يبشر بالخير لتوفير حلول لبعض التحديات العالمية الأكثر إلحاحا. مجموعة الهائل وأنواع من الفيروسات بالإضافة إلى خصائصها المثيرة للاهتمام أن يحتمل فرصا لا نهاية لها لتقديم الطلبات في التكنولوجيات القائمة على الفيروس. الفيروسات لديها القدرة على الى جزيئات منفصلة مع شكل وحجم والنوعية التناظر، polyvalence، وخصائص ثابتة في مجموعة واسعة من ظروف درجة الحرارة ودرجة الحموضة الذاتي تجميع. ليس من المستغرب، مع مجموعة رائعة من هذه الخصائص، ويقترح الفيروسات للاستخدام في المواد الحيوية اللقاحات 14 و 15، والمواد الالكترونية، وأدوات كيميائية، والحاويات الإلكترونية الجزيئية 4، 5، 10، 11، 16، 18، 12.

للاستفادة من الفيروسات في تكنولوجيا النانو، يجب تعديلها من أشكالها الطبيعية لنقل وظائف جديدة. هذا التحدي العلاقات العامةلا يمكن أن يؤديها من خلال عدة آليات صوتك بما في ذلك التحوير الوراثي للجينوم الفيروسي وربط جزيئات أجنبية أو كيميائيا المطلوب إلى مجموعات الجسيمات المتفاعلة الفيروس 8. القدرة على تعديل فيروس يعتمد بالدرجة الأولى على خصائص الفيزيائية والمادية للفيروس. وبالإضافة إلى ذلك، والتعديلات الجينية أو الفيزيائية تحتاج إلى القيام بها دون أن يؤثر ذلك سلبا على بنية الفيروس الأصلي وظيفة الفيروس. الذرة rayado فينو فيروس البروتينات معطف (MRFV) في الإشريكية القولونية المنتجة VLPs مستقرة وخالية من التي استقرت البروتين البروتين الذاتي التجمع ويمكن استخدام التفاعلات وذلك في التطبيقات المستندة إلى تقنيات الفيروس 8. تم فحص VLPs المنتجة في مصانع التبغ بوصفها سقالة التي يمكن أن مجموعة متنوعة من الببتيدات عرض تساهميا 13. هنا، نحن تصف خطوات ل1) تحديد أي من المذيبات cysteines الوصول إليها في قفيصة الفيروسات المتاحة لmodifiالموجبة، و 2) bioconjugate الببتيدات إلى تعديل capsids. باستخدام الأصلي أو إدخال mutationally-مخلفات الأحماض الأمينية ومستوى التقنيات اقتران، تم عرض تشكيلة واسعة من المواد الموجودة على سطح من الفيروسات النباتية مثل، فيروس تبرقش بروم قرنفل فيروس البرقشة 12، اللوبيا داء الاخضرار البرقشة فيروس فسيفساء التبغ فيروس 17، اللفت الأصفر فيروس فسيفساء وMRFV 13.

Protocol

1. التلقيح وتنقية الفيروسات من النباتات VLPs benthamiana نيكوتيانا توج T7-إنتاج نسخ من RNA فيروس البطاطا X (PVX) القائم على البلازميدات ناقلات تحمل MRFV البرية من نوع (وزن) والسيستئين-تحور البروتين معطف (CP) الجينات 12، ?…

Representative Results

عابر التعبير عن الجينات الطافرة معطف MRFV (CP) البروتين في N. يوصف النباتات benthamiana في VLPs ناقلات القائم على إنتاج PVX في الشكل 1. يتم تضخيمه معطف MRFV معدلة الجينات البروتين بواسطة PCR ثم وضعت تحت سيطرة الترانسكربتي من المروج subgenomic CP تكرار في ناقلات القائم على …

Discussion

طريقة المقدمة هنا يمكن تحليل حساسة جدا وسريعة رد الفعل cysteines موجودة على سطح VLPs التي ينتجها النبات وكذلك على مجمعات البروتين الأخرى. Maleimides هي ثيول محددة الكواشف، التي تتفاعل مع جزيئات سلفهيدريل المحتوية على حرية تشكيل السندات أثير ثيولي مستقرة. هذا الأسلوب يعتمد على ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments
Thinwall, Ultra-Clear Tubes Beckman 344059  
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Life Tecnologies AM1344M  
Fluorescein-5-Maleimide Thermo Scientific Life Technologies 46130 F150 46130 is out of order substitute with F150
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific 28005  
EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format Thermo Scientific 21901  
SM(PEG)n Crosslinkers Thermo Scientific 22107  
10-20% Tris-Glycine gel Invitrogen EC61352  
Laemmli Buffer Bio-Rad 1610737  
Tris Glycine SDS Running Buffer Invitrogen LC2675  
Tris Glycine Transfer Buffer Invitrogen LC3675  
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich Invitrogen LC2001  
Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG Kirkegaard and Perry Laboratories 0751516  
NBT/BCIP Phosphatase Substrate Kirkegaard and Perry Laboratories 508107  

References

  1. Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
  2. Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2, 549-557 (1992).
  3. Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. Packaging of gold particles in viral capsids. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).
  4. Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles. Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).
  5. Gazit, E. Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS. J. 274, 317-322 (2007).
  6. Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation. Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).
  7. Hammond, R. W., Hammond, J. Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli. Virus Res. 147, 208-215 (2010).
  8. Hermamson, G. T. . Bioconjugate techniques. , (1991).
  9. Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo. Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).
  10. Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires. Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).
  11. Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate. J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).
  12. Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus. Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).
  13. Natilla, A., Hammond, R. W. Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display. J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).
  14. Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route. Virology. 343, 2224-2235 (2005).
  15. Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus. Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).
  16. Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus. J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).
  17. Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
  18. Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).

Play Video

Cite This Article
Natilla, A., Hammond, R. W. Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs. J. Vis. Exp. (72), e50084, doi:10.3791/50084 (2013).

View Video