Summary

Analyse van de Solvent Toegankelijkheid van cysteïneresten op<em> Maïs rayado fino virus</em> Virus-achtige deeltjes, geproduceerd in<em> Nicotiana benthamiana</em> Plants and Cross-linking van peptiden aan VLP

Published: February 14, 2013
doi:

Summary

Werkwijze voor het oplosmiddel toegankelijkheid van de thiolgroep van cysteine ​​residuen van analyseren<em> Maïs rayado fino virus</em> (MRFV)-virus-achtige deeltjes (VLP's) gevolgd door een peptide vernettingsreactie beschreven. De methode maakt gebruik van de beschikbaarheid van verschillende chemische groepen op het oppervlak van de VLP's die het doelwit zijn van specifieke reacties.

Abstract

Het nabootsen van en het benutten van virus eigenschappen en fysisch-chemische en fysische eigenschappen houdt belofte om oplossingen te bieden om een ​​aantal van de meest urgente in de wereld uitdagingen. De enorme bereik en de soorten virussen gekoppeld aan hun intrigerende eigenschappen potentieel geven eindeloze mogelijkheden voor toepassingen in virus-gebaseerde technologieën. Virussen hebben de mogelijkheid om zelf te monteren in deeltjes met discrete vorm en grootte specificiteit van symmetrie, veelzijdigheid en stabiele eigenschappen onder een breed temperatuurbereik en pH-omstandigheden. Niet verrassend, met zo'n opmerkelijke scala van eigenschappen, zijn virussen voorgesteld voor gebruik in biomaterialen 9, vaccins 14, 15, elektronische materialen, chemische middelen, en moleculaire elektronische containers 4, 5, 10, 11, 16, 18, ​​12.

Om virussen in nanotechnologie gebruiken, moeten zij worden gewijzigd in hun natuurlijke vorm om nieuwe functies geven. Deze uitdagende process kan worden uitgevoerd via verschillende mechanismen waaronder genetische modificatie van het virale genoom en chemisch verbonden buitenlandse of gewenste moleculen voor het virusdeeltje reactieve groepen 8. De mogelijkheid om een ​​virus te passen vooral afhangt van de fysisch-chemische en fysische eigenschappen van het virus. Bovendien de genetische of fysisch aanpassingen moeten worden uitgevoerd zonder dat de virus natieve structuur en functie virus. Maize rayado fino virus (MRFV) manteleiwitten zelf-assembleren in Escherichia coli produceren stal en lege VLP die gestabiliseerd door eiwit-eiwit interacties en die gebruikt kunnen worden in virus-gebaseerde technologieën toepassingen 8. VLP's geproduceerd in tabaksplanten onderzocht als een steiger waarop verschillende peptiden covalent worden weergegeven 13. Hier beschrijven we de stappen 1) bepalen welke van de oplosmiddel-toegankelijke cysteines in een viruscapside beschikbaar voor wijzikation en 2) Bioconjugate peptiden om de gewijzigde capsiden. Met natieve of mutationally ingestoken aminozuurresten en standaard koppeling technologieën hebben vele verschillende materialen zijn op het oppervlak van plantenvirussen zoals Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12 Cowpea chlorotic mottle virus 6, tabaksmozaïekvirus virus 17, Turnip geel mozaïek virus 1 en MRFV 13.

Protocol

1. Virusinoculatie en VLP Zuivering van Nicotiana benthamiana Planten Produceren afgedekt T7-RNA transcripten van aardappelvirus X (PVX) gebaseerde vector plasmiden met MRFV wild-type (wt) en Cys-gemuteerde manteleiwit (CP) genen 12, met Ambion de T7-mMessage mMachine Kit. Voor elke T7 transcriptie reactie inoculeren twee volgroeide bladeren van N. benthamiana met 10 ui reacties en incubeer de planten gedurende 10 dagen in de kas, bij 60% luchtvochtigheid gedure…

Representative Results

Tijdelijke expressie van mutant MRFV manteleiwit (CP) genen in N. benthamiana planten in een PVX-vector based producerende VLP wordt beschreven in figuur 1. De gewijzigde MRFV manteleiwitgen wordt geamplificeerd door PCR en vervolgens onder de transcriptionele controle van de dubbele subgenomische CP promoter in een PVX-vector based, pP2C2S 2 (een gift van D. Baulcombe, Sainsbury Laboratories, Norwich, Engeland). In vitro RNA transcriptie produceert RNA transcripten die daar…

Discussion

De werkwijze die hier maakt een zeer gevoelige en snelle analyse van reactieve cysteïnen aanwezig op het oppervlak van VLP van plantaardige en op andere eiwitcomplexen. Maleïmiden zijn thiol-specifieke reagentia die reageren met vrije sulfhydryl-bevattende moleculen stabiele thioether bindingen. Deze methode is gebaseerd op de specificiteit van de maleïmides te reageren met sulfhydrylgroepen niet betrokken bij interacties met andere aminozuren. Behoud van de natieve structuur van de VLP erg belangrijk het gehele proc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments
Thinwall, Ultra-Clear Tubes Beckman 344059  
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Life Tecnologies AM1344M  
Fluorescein-5-Maleimide Thermo Scientific Life Technologies 46130 F150 46130 is out of order substitute with F150
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific 28005  
EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format Thermo Scientific 21901  
SM(PEG)n Crosslinkers Thermo Scientific 22107  
10-20% Tris-Glycine gel Invitrogen EC61352  
Laemmli Buffer Bio-Rad 1610737  
Tris Glycine SDS Running Buffer Invitrogen LC2675  
Tris Glycine Transfer Buffer Invitrogen LC3675  
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich Invitrogen LC2001  
Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG Kirkegaard and Perry Laboratories 0751516  
NBT/BCIP Phosphatase Substrate Kirkegaard and Perry Laboratories 508107  

References

  1. Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
  2. Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2, 549-557 (1992).
  3. Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. Packaging of gold particles in viral capsids. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).
  4. Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles. Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).
  5. Gazit, E. Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS. J. 274, 317-322 (2007).
  6. Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation. Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).
  7. Hammond, R. W., Hammond, J. Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli. Virus Res. 147, 208-215 (2010).
  8. Hermamson, G. T. . Bioconjugate techniques. , (1991).
  9. Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo. Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).
  10. Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires. Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).
  11. Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate. J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).
  12. Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus. Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).
  13. Natilla, A., Hammond, R. W. Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display. J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).
  14. Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route. Virology. 343, 2224-2235 (2005).
  15. Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus. Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).
  16. Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus. J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).
  17. Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
  18. Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).

Play Video

Cite This Article
Natilla, A., Hammond, R. W. Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs. J. Vis. Exp. (72), e50084, doi:10.3791/50084 (2013).

View Video