El método se describe el aislamiento y caracterización de células humanas de la Pulpa Dental madre (hDPSCs) mediante el uso de cualquiera de los dos<strong> Disociación enzimática de la pulpa (DPSC-ED)</strong> O<strong> Consecuencia directa de las células madre a partir de explantes de tejido pulpar (DPSC-OG). A continuación, seguido por</strong><em> In vitro</em> Diferenciación comparativo de ambos tipos de hDPSCs en odontoblastos.
Las células madre son células clonigénicas que poseen dos características notables, conocidas como multi-potencia y auto-renovación 15. Entre todas las células madre con potencias diferentes replicativos, las células madre dentales como las células madre postnatales han llamado la atención en los últimos años debido a su accesibilidad, la plasticidad y alta capacidad proliferativa en comparación con otras células madre adultas 16. Característicamente, similar a las células madre mesenquimales, células madre de pulpa dental están adheridas las células clonogénicas que tienen la capacidad de diferenciación en múltiples mesénquima y / o no-mesénquima linajes, tanto in vitro como in vivo. 1-8,17,18 DPSCs se identifican por su expresión negativa de antígenos hematopoyéticos (por ejemplo, CD45, CD34, CD14), y la expresión positiva de CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 y STRO 1-19,20.
Fácil potencial obtenida con un mínimo de dolor y morbilidad hacer DPSCs humanos como una valiosafuente capaz de MSCs en comparación con las fuentes comunes, tales como células madre mesenquimales de la médula ósea 21. En general, DPSCs se han aislado por cualquier método de derivación, es decir, la migración de las células madre a partir de explantes de tejido de pulpa (DPSC-OG) 22-24, y / o mediante digestión enzimática (DPSC-ED) 4,6,25. Estudios anteriores han demostrado que el método de aislamiento y las condiciones de cultivo pueden inducir diferentes poblaciones o linajes bajo pasajes in vitro 26,27. En el caso de los dientes permanentes (pDPSCs), Huang et al puesto de manifiesto que enzimáticas pDPSCs digeridos tienen un mayor potencial de proliferación en comparación con los DPSCs superado. 26 Por otra parte, en el caso de los dientes deciduos (dDPSCs), se demostró que STRO-1 y CD34 marcadores expresa más en DDPSC-DE en comparación con DDPSC-OG. Además, DDPSC-ED mostraron un aumento significativo en la tasa de mineralización definida osteo / odonto medio. 27 Por lo tanto, debido al gran potencial de DPSCs en regenerative medicina, más estudios se requerirán para un mejor entendimiento de las posibles poblaciones diferentes que se derivan de diferentes métodos de aislamiento.
Aquí, era intento de introducir de manera fácil extracción de la pulpa, mediante el uso de un solo paso disco de diamante dental para facilitar el proceso de extracción de la pulpa. Por otra parte, tras el aislamiento de las células madre derivadas de la pulpa mediante la aplicación de métodos o ED OG, propiedades generales y capacidad de diferenciación entre dos grupos también fueron investigados.
Este protocolo describe el proceso de aislamiento y caracterización de hDPSCs de pulpa dental utilizando dos métodos, la disociación enzimática y la consecuencia directa de las células madre a partir de explantes de tejido de la pulpa. Además, la diferenciación in vitro de estas células en odontoblastos, se evaluó por el ensayo cuantitativo rojo de alizarina S & QPCR.
Los protocolos existentes para el aislamiento de tejido de la pulpa de los dientes humanos se …
The authors have nothing to disclose.
Queremos agradecer a la Dra. Leila Shakeri y el Dr. Aref Dournaei para su discusión crítica y el Sr. Mohammad Reza Khadem Sharif por su apoyo técnico.
Name of the reagent | Company | Catalogue or Lot. number | Comments (optional) |
α-MEM | GIBCO | 11900-073 | |
Collagenase type I | Sigma-Aldrich | C0130-100MG | |
Dispase | GIBCO | 17105-041 | |
Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
Fetal Bovine serum defined (FBS) | HyClone | SH30070.03 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
L-glutamine | GIBCO | 25030-024 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra | Sigma | G9422-100G | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Osteogenesis Assay Kit | Millipore | PS01802031 | |
Mouse IgG2b-PE isotype control | BD pharmingen | 50808088029 | |
FITC mouse IgG2b isotype control | BD pharmingen | 559532 | |
FITC mouse IgG1 κ isotype | BD pharmingen | 11471471 | |
FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 | BD pharmingen | 341071 | |
PE anti-human CD146 | BD pharmingen | 550315 | |
Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC | Daka | 00034418 | |
PE mouse anti-human CD73 | BD pharmingen | 550257 | |
Anti-h CD105/Endoglin PE | BD pharmingen | FAB10971P | |
PE mouse anti-human CD11b/Mac1 | BD pharmingen | 5553888 | |
CD44 PE mouse anti human | BD pharmingen | 555479 | |
Phosphate buffer Solution (PBS) | GIBCO | 003000 | |
70-μm cell strainer | Falcon | 352360 | |
0.2 μm syringe filter | Millex-GV | SLGV033RB | |
25 cm2 culture flask | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
EQUIPMENT | |||
BD FACSCalibur | BD | 342975 | |
multiskan microplate spectrophotometer | Thermo scientific | 51119200 | |
Fleurcense Microscope | Olympus | ||
Flowing Software version 2.3.1 |