De werkwijze beschreven isolatie en karakterisering van menselijke pulpa stamcellen (hDPSCs) door ofwel<strong> Enzymatische dissociatie van pulp (DPSC-ED)</strong> Of<strong> Directe uitgroei van stamcellen uit pulp weefselexplantaten (DPSC-OG). Gevolgd door</strong><em> In vitro</em> Vergelijkende differentiatie van beide soorten hDPSCs in odontoblasts.
Stamcellen zijn cellen die klonogene twee opmerkelijke eigenschappen, bekend als multi-potentie en zelfvernieuwing 15 bezitten. Van alle stamcellen met verschillende replicatieve vermogens, hebben tandheelkundige stamcellen als postnatale stamcellen gewezen laatste jaren vanwege hun toegankelijkheid, plasticiteit en hoge proliferatieve vermogen in vergelijking met andere volwassen stamcellen 16. Kenmerkend vergelijkbaar met de mesenchymale stamcellen, dentale pulp stamcellen zijn hechtende klonogene cellen die meerdere differentiatiecapaciteit in mesenchym en / of niet-mesenchym lineages, zowel in vitro als in vivo. 1-8,17,18 DPSC's worden geïdentificeerd door hun negatieve uitdrukking van hematopoietische antigenen (bijv. CD45, CD34, CD14), en positieve uitdrukking van CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 en STRO-1. 19,20
Gemakkelijk verkregen potentieel met een minimum aan pijn en ziekte te maken menselijke DPSC's als een waardevollekunnen bron van MSCs in vergelijking met de gewone bronnen, zoals beenmerg mesenchymale stamcellen 21. In het algemeen zijn DPSC's zijn geïsoleerd door een uitwas werkwijze, dwz migratie van stamcellen uit pulp weefselexplantaten (DPSC-OG) 22-24, en / of door enzymatische digestie (DPSC-ED) 4,6,25. Eerdere studies hebben aangetoond dat de isolatiemethode en kweekomstandigheden kunnen verschillende populaties of geslachten er onvoldoende in vitro passages 26,27. In geval van blijvende tanden (pDPSCs), Huang et al. toonde aan dat enzymatische digestie pDPSCs hogere proliferatie potentie vergeleken met de ontgroeid DPSC's. 26 Bovendien, in het geval van melktanden (dDPSCs), werd aangetoond dat STRO-1 en CD34 markers, uitgedrukt in dDPSC-ED in vergelijking met dDPSC-OG. Bovendien dDPSC-ED weergegeven hogere mineralisatie in bepaalde osteo / odonto medium. 27 Derhalve dankzij de uitstekende mogelijkheden van DPSC's in regenerative geneeskunde, meer studies nodig voor een beter begrip van mogelijke verschillende populaties die zijn afgeleid van verschillende isolatiemethoden.
Hier was poging makkelijke manier pulp extractie voeren, met eentraps tandheelkundige diamantschijf de pulp extractie te vergemakkelijken. Bovendien, na isolatie van humane pulp-stamcellen door toepassing of ED OG werkwijzen werden algemene eigenschappen en differentiatiecapaciteit tussen twee groepen onderzocht.
Dit protocol beschrijft het proces van isolatie en karakterisering van hDPSCs van tandheelkundige pulp met behulp van twee methoden, enzymatische dissociatie en directe uitgroei van stamcellen uit pulp weefselexplantaten. Bovendien in vitro differentiatie van deze cellen naar odontoblasts, werd bepaald door kwantitatieve assay Alizarinerood S & QPCR.
Bestaande protocollen voor het isoleren van pulp weefsel van menselijke tand werd gebruik gemaakt van verschillende instrumenten z…
The authors have nothing to disclose.
Wij dankbaar erkennen Dr Leila Shakeri & Dr Aref Dournaei voor hun kritische discus en de heer Mohammad Reza Khadem Sharif voor zijn technische ondersteuning.
Name of the reagent | Company | Catalogue or Lot. number | Comments (optional) |
α-MEM | GIBCO | 11900-073 | |
Collagenase type I | Sigma-Aldrich | C0130-100MG | |
Dispase | GIBCO | 17105-041 | |
Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
Fetal Bovine serum defined (FBS) | HyClone | SH30070.03 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
L-glutamine | GIBCO | 25030-024 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra | Sigma | G9422-100G | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Osteogenesis Assay Kit | Millipore | PS01802031 | |
Mouse IgG2b-PE isotype control | BD pharmingen | 50808088029 | |
FITC mouse IgG2b isotype control | BD pharmingen | 559532 | |
FITC mouse IgG1 κ isotype | BD pharmingen | 11471471 | |
FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 | BD pharmingen | 341071 | |
PE anti-human CD146 | BD pharmingen | 550315 | |
Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC | Daka | 00034418 | |
PE mouse anti-human CD73 | BD pharmingen | 550257 | |
Anti-h CD105/Endoglin PE | BD pharmingen | FAB10971P | |
PE mouse anti-human CD11b/Mac1 | BD pharmingen | 5553888 | |
CD44 PE mouse anti human | BD pharmingen | 555479 | |
Phosphate buffer Solution (PBS) | GIBCO | 003000 | |
70-μm cell strainer | Falcon | 352360 | |
0.2 μm syringe filter | Millex-GV | SLGV033RB | |
25 cm2 culture flask | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
EQUIPMENT | |||
BD FACSCalibur | BD | 342975 | |
multiskan microplate spectrophotometer | Thermo scientific | 51119200 | |
Fleurcense Microscope | Olympus | ||
Flowing Software version 2.3.1 |