Mal plegamiento de proteínas priones de amplificación cíclica
Summary
Misfolding proteína amplificación cíclica (EPCP) es un ensayo in vitro para el estudio de la conversión de priones y barreras cepa y especie. También se puede utilizar como un ensayo de detección de priones.
Abstract
Los priones son los agentes infecciosos causantes de la encefalopatía espongiforme transmisible inevitablemente fatal (EET) en los animales y los seres humanos 9,18. La proteína prión tiene dos isoformas distintas, la no infecciosa proteína codificada por el hospedador (PrP C) y la proteína infecciosa (PrP Sc), una isoforma anormal de PrP plegado en C 8.
Uno de los retos de trabajar con agentes de priones es el largo período de incubación antes de la aparición de los signos clínicos después de la inoculación de acogida 13. Este mandato tradicionalmente los estudios en animales largos y caros de bioensayo. Además, las propiedades bioquímicas y biofísicas de PrP Sc están pobremente caracterizados debido a su conformación inusual y estados de agregación.
PrP Sc puede sembrar la conversión de PrP C y PrP Sc in vitro 14. El EPCP es una técnica in vitro que se Advantage de esta capacidad utilizando ciclos de sonicación y la incubación para producir grandes cantidades de PrP Sc, a un ritmo acelerado, a partir de un sistema que contiene cantidades en exceso de PrP C y pequeñas cantidades de la semilla PrP Sc 19. Esta técnica ha demostrado ser eficaz para recapitular la especificidad de especie y cepa de PrP Sc conversión de PrP C, para emular interferencia cepa de priones, y para amplificar los niveles muy bajos de PrP Sc partir de tejidos infectados, fluidos y muestras ambientales 6,7,16, 23.
Este documento detalla el protocolo EPCP, incluyendo recomendaciones para minimizar la contaminación, generando resultados consistentes, y la cuantificación de los resultados. También se discuten varias aplicaciones del EPCP, incluyendo la generación y caracterización de cepas de priones infecciosos, la interferencia cepa de prión, y la detección de priones en el medio ambiente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desafíos de la amplificación de las proteínas priónicas infecciosas son los períodos de incubación largos y los gastos de los experimentos in vivo. La técnica EPCP es un medio rentable para amplificar los agentes infecciosos de priones. Varios laboratorios han confirmado la capacidad de PMCA para amplificar con precisión las cepas de priones in vitro 7, 9, 12, 14, 19,24.
Las enfermedades por priones se pueden transmitir entre especies. Bessen y M…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Marie Ramos Vesper Fe para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional para Recursos de Investigación (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 y G20RR024001) y el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (2R01 NS052609).
Materials
| Reagent / Equipment | Manufacturer | Cat. Number |
| Misonix 3000 | Misonix | S-3000 |
| Misonix 4000 | Misonix | S-4000 |
| Tenbroeck Tissue Grinder | Kontes | 885000-0007 |
| Neslab EX-7 Water Bath | Thermo Electron | Neslab EX-7 |
| 0.2 ml PCR Tube Strips | Thermo Scientific | AB-0451 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-100ML |
| Complete Protease Inhibitor | Roche | 11 697 498 001 |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-00 |
| DPBS | Mallinckrodt Baker Mediatech | 21-031-CV |
| Versi-Dry Lab Soakers | Fisher Scientific | 14 206 28 |
| Repti Therm Heater | Zoo Med Laboratories, Inc. | RH-4 |
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