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Immunology and Infection

プリオンのタンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅

Published: November 07, 2012
doi:
10.3791/4075
, ,
1Department of Civil Engineering,University of Nebraska at Lincoln, 2Department of Medical Microbiology and Immunology,Creighton University

Summary

タンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅（PMCA）はプリオン変換とひずみと種の壁の研究のためのin vitroアッセイである。また、プリオン検出アッセイとして使用することができます。

Abstract

プリオンは、動物とヒト9,18で必然的に致命的な伝達性 ​​海綿状脳症（TSE）を引き起こす感染性病原体である。プリオンタンパク質は、2つの異なるアイソフォームは、非感染性宿主でエンコードされたタンパク質（PrP C）および感染質（PrP Sc）は、PrP Cの8の異常に折り畳まれたアイソフォームを持っています。

プリオン剤での作業の課題の1つは、ホスト13接種後の臨床徴候の開発の前に長い潜伏期間があります。これは、伝統的に長く、高価な動物のバイオアッセイ研究を命じた。さらに、PrP Scの生化学的および生物物理学的特性はあまり彼らの異常なコンフォメーションと凝集状態に起因する特徴がある。

PrP Sc は 試験管 14 内 の PrP ScへのPrP Cの種子変換することができます。 PMCAはアドバを取るのin vitro手法ですのPrP CとPrP Scの種子19微量の過剰な量を含んでいるシステムから、加速度的に、PrP Scのを大量に生成するために超音波処理およびインキュベーションサイクルを使用してこの能力のntage。この手法は、効果的にプリオン株の干渉をエミュレートするためには、PrP CからPrP Scの変換の種および株特異性を再現するために、感染した組織、体液、および環境試料6,7,16からPrP Scの非常に低いレベルを増幅することが証明されています23。

一貫性のある結果を生成し、それらの結果を定量化、汚染を最小限にするための提言を含め、本稿では詳細PMCAプロトコルを、。我々はまた、感染性プリオン株、プリオン株の干渉、及び環境中のプリオンの検出の発生と特性化など、いくつかのPMCAアプリケーションを、議論する。

Protocol

1。機器の準備 Misonix 3000または37の温度を一定に保つためにサーモエレクトロンNeslab EX-7水槽（ニューイントン、ニューハンプシャー州）に接続Misonix 4000ソニケーター（ファーミングデール、ニューヨーク州）℃を使用するサーモサイエンティフィック（ウォルサム、マサチューセッツ州）から入手したドーム型のキャップ付き200μlの薄壁PCRチューブストリップのサンプルを超音波洗?…

Representative Results

タンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅（PMCA）はin vitroで 7 におけるPrP Scは、12、14、19、24を増幅するために使用されます。 図3に示すように、成功したPrP Scの増幅が PK耐性プリオンタンパク質（ハムスター由来のプリオン株の19および30kDaの間の移行）のウエスタンブロットのバンド強度の増加によって示されている<str…

Discussion

感染性プリオンタンパク質を増幅するという課題は、長い潜伏期間および in vivo実験での経費です。 PMCA技術は感染性プリオンエージェントを増幅するための費用効果的な手段です。いくつかの研究室では、正確に試験管 7、9、12、14、19,24 のプリオン株を増幅するPMCAの能力を確認しています。

プリオン病は、種間で送信することができ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は、原稿の批判的な読みのために博士はヴェスパーのFeマリーラモスに感謝したいと思います。この作業は、研究資源のためのナショナルセンター（P20 RR0115635-6、C06 RR17417-01とG20RR024001）と国立神経疾患研究所およびストローク（2R01 NS052609）によってサポートされていました。

Materials

Reagent / Equipment Manufacturer Cat. Number
Misonix 3000 Misonix S-3000
Misonix 4000 Misonix S-4000
Tenbroeck Tissue Grinder Kontes 885000-0007
Neslab EX-7 Water Bath Thermo Electron Neslab EX-7
0.2 ml PCR Tube Strips Thermo Scientific AB-0451
Triton X-100 Sigma Aldrich T9284-100ML
Complete Protease Inhibitor Roche 11 697 498 001
EDTA J.T. Baker 4040-00
DPBS Mallinckrodt Baker Mediatech 21-031-CV
Versi-Dry Lab Soakers Fisher Scientific 14 206 28
Repti Therm Heater Zoo Med Laboratories, Inc. RH-4
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References

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Protein MisfoldingCyclic AmplificationPrionsTransmissible Spongiform EncephalopathyPrPCPrPScIncubation PeriodClinical SignsAnimal Bioassay StudiesBiochemical PropertiesBiophysical PropertiesIn Vitro TechniqueSonicationIncubation CyclesPrPSc SeedSpecies SpecificityStrain SpecificityPrion Strain InterferenceAmplificationFluidsEnvironmental SamplesPMCA ProtocolContamination ControlConsistent ResultsQuantification

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Saunders, S. E., Bartz, J. C., Shikiya, R. A. Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions. J. Vis. Exp. (69), e4075, doi:10.3791/4075 (2012).
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