Proteinfehlfaltungen Cyclic Amplification von Prionen
Summary
Proteinfehlfaltung zyklischen Amplifikation (PMCA) ist ein in vitro-Assay zur Untersuchung von Prionen Umwandlung und Dehnung und Artgrenzen. Es kann auch als ein Prion-Nachweis-Assay verwendet werden.
Abstract
Prionen sind infektiöse Agenzien, die unweigerlich tödlichen übertragbaren spongiformen Enzephalopathie (TSE) verursachen bei Menschen und Tieren 9,18. Das Prionprotein hat zwei verschiedene Isoformen, die nicht-infektiösen Host-codierte Protein (PrP C) und das infektiöse Protein (PrP Sc), eine abnormal gefaltete Isoform von PrP C 8.
Eine der Herausforderungen bei der Arbeit mit Prion-Agenten ist die lange Inkubationszeit vor der Entwicklung von klinischen Anzeichen nach Host Inokulation 13. Das traditionell langen und teuren Tier-Bioassay Studien beauftragt. Darüber hinaus werden die biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften von PrP Sc schlecht charakterisiert durch ihre ungewöhnliche Konformation und Aggregation Staaten.
PrP Sc kann Saatgut die Umwandlung von PrP C zu PrP Sc in vitro 14. PMCA ist ein in vitro-Technik, nimmt advantage dieser Fähigkeit mit Ultraschallbehandlung und Inkubation Zyklen, große Mengen an PrP Sc zu erzeugen, mit einer beschleunigten Rate von einer Anlage mit überschüssigen Mengen an PrP C und winzige Mengen des PrP Sc Saatgut 19. Diese Technik hat sich als wirksam rekapitulieren die Art und Stamm von PrP Sc Spezifität Umwandlung von PrP C zu Prionenstamm Interferenz emulieren, und mit sehr geringen Mengen von PrP Sc aus infizierten Geweben, Fluiden, und Umweltproben 6,7,16 amplifizieren, 23.
Dieses Papier Details der PMCA Protokoll, einschließlich Empfehlungen zur Minimierung Kontamination Erzeugung konsistente Ergebnisse und Quantifizierung dieser Ergebnisse. Wir diskutieren auch mehrere PMCA Anwendungen, einschließlich der Erzeugung und Charakterisierung von Prion-Stämme, Prionenstamm Störungen, und der Nachweis von Prionen in der Umwelt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Herausforderungen der Verstärkung infektiöse Prion-Proteine sind die langen Inkubationszeit und die Kosten der In-vivo-Experimente. Die PMCA Technik ist ein kostengünstiges Mittel, um infektiöse Prion-Agenten zu verstärken. Mehreren Laboratorien haben die Fähigkeit, genau zu amplifizieren PMCA Prionenstämme in vitro 7, 9, 12, 14, 19,24 bestätigt.
Prion-Erkrankungen können zwischen verschiedenen Arten übertragen werden. Bessen und Marsh haben effek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Dr. Vesper Fe Marie Ramos für die kritische Durchsicht des Manuskripts danken. Diese Arbeit wurde vom National Center for Research Resources (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 und G20RR024001) und dem National Institute for Neurological Disorders and Stroke (2R01 NS052609) unterstützt.
Materials
| Reagent / Equipment | Manufacturer | Cat. Number |
| Misonix 3000 | Misonix | S-3000 |
| Misonix 4000 | Misonix | S-4000 |
| Tenbroeck Tissue Grinder | Kontes | 885000-0007 |
| Neslab EX-7 Water Bath | Thermo Electron | Neslab EX-7 |
| 0.2 ml PCR Tube Strips | Thermo Scientific | AB-0451 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-100ML |
| Complete Protease Inhibitor | Roche | 11 697 498 001 |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-00 |
| DPBS | Mallinckrodt Baker Mediatech | 21-031-CV |
| Versi-Dry Lab Soakers | Fisher Scientific | 14 206 28 |
| Repti Therm Heater | Zoo Med Laboratories, Inc. | RH-4 |
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