Intranazal aşılara farelerin burun ve sistemik immün yanıtlar için nazofaringeal ilişkili lenforetiküler dokular (NALT) katkılarını incelemek için Yöntemler açıklanmıştır. Biz NALT bağımlı fare modeli kurmak için bir cerrahi prosedür göstermek ve<em> Ex vivo</emAyıklanan NALT of> kültürleri.
İnsanlarda, kemirgenlerden ve diğer memelilerde bulunan nazofarenks ilişkili lenforetiküler dokular (NALT), 1-3 nazal sinüslerde bağışıklık katkıda bulunur. NALT sert damak yukarıda burun pasajda bulunan iki paralel çan şeklindeki yapılardır ve genellikle mukoza ilişkili lenfoid sistemin 4-6 ikincil bileşenleri olarak kabul edilir. Dendritik hücreler 4,7,8 antijen sunan serpiştirilmiş B ve T lenfositlerinin ayrık bölümlerdir NALT içinde yer alır. Bu hücreler hava yollarını 9,10 mukoza yüzeylerinden antijen alımı için sorumlu M-hücreleri ile ardalanmalı bir epitel hücre tabakası ile çevrilidir. NALT dolaşan Naif lenfositler solunum patojenleri 7 ile ilk karşılaştığında yanıt gurur duyuyoruz. NALT iki yaş insanlarda yok olurken, Waldeyer Yüzükler ve benzer yapıdaki lenfatik organlarda th devam devamömrü 6 roughout. İnsanlarda aksine, farelerin dolayısıyla nazal sinüslerde 11 içinde kaynaklanan immün yanıtların çalışma için uygun bir hayvan modeli sunan, hayatı boyunca NALT korurlar.
NALT tek hücre süspansiyonları kültürleri nedeniyle mononükleer hücrelerden, düşük verimler için pratik değildir. Bununla birlikte, NALT biyolojisi bozulmadan organın ex vivo kültürlenmesi ile incelendi ve bu yöntem, doğal doku yapısı sürdürmenin ilave bir avantajı vardır edilebilir. In vivo çalışmalar için NALT sınırlı kusurları başvuran genetik nakavt modelleri gelişim süreçleri zayıf bir anlayış nedeniyle henüz mevcut değildir. Lenfotoksin-α nakavt fareler NALT körelmiş olurken Örneğin, Peyer en yamalar, periferik lenf düğümleri, foliküler dendritik hücreler ve diğer lenfoid dokularda da bu genetik olarak manipüle farelerde 12,13 ile değiştiği saptanmıştır. Gen knockout farelerde alternatif, cerrahi ablasyon p olarakermanently diğer dokulara etkilemeden nazal pasajdan NALT ortadan kaldırır. Çıkan fare modeli aşılar 1,3 NALT ve immün yanıtı arasındaki ilişkileri kurmak için kullanılmıştır. Serum, tükürük, burun yıkama ve vajinal salgıların Seri toplama NALT doğrudan kaynaklanan bağışıklık yanıtlarını doku kültürü ile teyit edilebilir ise, aşı konakçı tepkileri temelinde kurulması için gereklidir. Aşağıdaki yordamlar gerekli ameliyatları, doku kültürü ve örnek toplama intranazal (IN) aşılama için yerel ve sistemik hümoral yanıtlarda incelemek için özetledik.
Biz biyolojik örnekler ve NALT ilişkili immün yanıtlar 1-4 incelenmesi için testler elde, bir hayvan modeli geliştirmek için ortak yöntemler sundu. Bu yöntemlerin uygulanması sırasında dikkate almanız gereken ek faktörler vardır. Cerrahi ve doku kültürü için standart steril teknikler takip edilmelidir. Izolasyon ve kültür gibi sterilize aletler, çalışma alanı ve dezenfekte damak bakımı sırasında kullanılan antibakteriyel ve antifungal bir kombinasyonu bulaşma riskini azaltacaktır. Serum antikorları genellikle yüksek konsantrasyonlarda bulunur gibi tükürük, burun yıkama ve benzeri mukozal sekresyon örnekleri, kan potansiyel kontaminasyon açısından kontrol edilmelidir. Antikorların daha düşük konsantrasyonlarda serumu ile karşılaştırıldığında, bu örnekler mevcut olduğundan daha fazla, mukozal salgılar sadece hafifçe analizi için seyreltilmiştir edilmelidir.
Fareler öncesi doğrudan ameliyattan sonra sıcak tutulmalıdırpotansiyel anestezi bağlı hipotermi için önlem alınmalıdır. Onların yüzüne Alternatif dinlenme fareler ameliyat sonrası iyileşme sırasında düzensiz solunum aza indirmek için. Cerrahi işlem bu görevleri tamamlamak için birlikte çalışan üç kişinin daha verimlidir: fareler anestezi kurtarmak olarak cerrahi tedavi bir, ağız açık tutarak yardımcı olmak için, diğeri de ameliyat sonrası bakım sağlamak.
Her fare için ameliyatın başarı doğrulamak için tüm deneysel prosedürleri veya çalışmaların sonunda kraniyal kesitler H & E boyama kullanmak gereklidir. Olası cerrahi sonuçlar şunlardır: eksiksiz ve ikili NALT ablasyon, eksik ablasyon, veya bozulmamış NALT. Tüm cerrahi kalıntı veya bozulmamış NALT ile tam NALT kaybı, hayvanlar neden olur, çünkü iç kontroller olarak kullanılabilir. Başka bir olası sonuç damak burun ve ağız boşlukları bağlayan bir açıklık bırakarak, tamamen iyileşmek için başarısız olur. Eksikdamak iyileşme, düşük ağırlığı ve gelişme geriliği neden olacaktır ve bu kişilerin çalışma çıkarılmalıdır.
Fare modeli ile ilk aşı yanıtı incelenmesi amaçlanan çalışma sonucu (antikor yanıtı, hayatta kalma, vb) NALT için bir rol kurmak için görev yapacak. Cerrahi NALT kaldırarak yerel ve sistemik bağışıklık burun katkıların belirlenmesi kolaylaştırır. Burada anlatılan cerrahi yaklaşım NALT yoksun bir fare modeli elde etmek için en doğrudan bir yöntemdir. Knock-out fare modelleri seçin eksikliği NALT bildirilmiş, ancak bu hayvanlar da sitokinler veya diğer ikincil lenfoid dokuların gelişimi için gereklidir kemokinler eksik olduğunu ve ek kusurları 12,13 barındıran olabilir edilmiştir. Ayrıca, burada açıklanan yöntemlerden burun pasajda içinde kaynaklanan bağışıklık yanıtlarını çeşitli yönlerini incelemek için geliştirilmiştir. Bizim deney sonuçları tüm üst palat kullanarak çalışmalarına dayanmaktadırdoku kültürü için fare e, bu bölümlerde kullanılan olasıdır ancak. Son olarak, kültür NALT doku kültürü modeli olarak tamamen deneyler için yararlıdır.
The authors have nothing to disclose.
Destek Becton Dickinson Technologies tarafından sağlanmıştır. Bu teslimiyet ifade Görüntüleme yazarlara aittir ve ABD hükümetinin resmi politikasını yansıtması iddiasında değildir. Araştırma Hayvan Refahı Yasası hayvanların ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı, Ulusal Araştırma Konseyi, 1996 Kılavuzunda belirtilen esaslara yapışır kapsayan hayvan ve deneyler ile ilgili diğer federal kanun ve yönetmeliklere uygun olarak yapılmıştır. Bu araştırma yapılmıştır tesis Laboratuar Hayvan Bakımı Uluslararası Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği tarafından tamamen akredite edilmiştir.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Stainless Steel Sterile Surgical Blades, No. 11 | Miltex | 4-311 | |
Knife Handle, No. 3 | Miltex | 4-7 | |
48-well Cell Culture Plates | Costar | 3548 | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Gibco/Invitrogen | 16000-044 | Final Conc: 10% by volume in culture media |
Streptomycin Sulfate | Sigma | S9137 | Final Conc: 100 μg/mL |
Penicillin | Sigma | P7794 | Final Conc: 100 UI/mL |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | Final Conc: 50 μg/mL |
Fungizone | Gibco/Invitrogen | 15290-018 | Final Conc: 1 μg/mL |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Conc: 10 mM |
Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022364111 | |
Nutra-gel Cherry Flavored Mouse Wet Food | Bio-Serve | S4798-TRAY | |
Metacam | Boehringer Ingelheim | 601531000 | One drop of 1.5 mg/mL Oral Suspension |
Ketamine | Pfizer | 00856440301 | Final Conc: 6.06 mg/mL |
Acepromazine | Vedco | VEDC207 | Final Conc: 0.061 mg/mL |
Xylazine | Lloyd | 4811 | Final Conc: 0.667 mg/mL |
Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | 1621 | |
0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter | 2B1302 | |
0.5 mm Microcurette | Roboz | RS-6350 | |
Thermal Cautery Unit | Geiger | 150-S/150A-S | |
TCU Replacement Tip, Straight Fine Loop | Geiger | 214 | |
Surgical Scissors | |||
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma | HT501128 | |
Formic Acid | Fisher | A119P-4 | Mix 426 mL formic acid into 1047 mL tap water, then add 45 mL Rexyn 101 (H) |
Rexyn 101 (H) | Fisher | R231-500 | |
Tissue-Tek VIP E150/E300 | Sakura | ||
Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
Mayer’s Hematoxylin | Sigma | MHS16-500ML | |
Gill No.1 Hematoxylin | Sigma | GHS116 | |
Eosin B | Sigma | 2853 | |
Microtainer Serum Separator | BD Medical | 365956 | |
Phosphate Buffered Saline | 100 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4 | ||
Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free | Thermo Scientific | 78415 |