שיטות לבחון את תרומתם של האף והלוע הקשורים רקמות lymphoreticular (NALT) על המערכת החיסונית האף מערכתית של עכברים לחיסונים אפי מתוארים. אנחנו מדגימים ניתוח לבסס מודל NALT תלוי העכבר<em> לשעבר vivo</em> תרבויות NALT חילוץ.
את האף והלוע הקשורים רקמות lymphoreticular (NALT) נמצאו אצל בני אדם, מכרסמים, ויונקים אחרים, לתרום חסינות הסינוסים באף 1-3. NALT שני מקבילים פעמון מבנים הממוקמים את מעברי האף מעל החיך הקשה, והם נחשבים בדרך כלל להיות מרכיבים משניים של מערכת הרירית הקשורים הלימפה 4-6. ממוקם בתוך NALT הם תאים נפרדים של לימפוציטים מסוג B ו-T-וביניהם אנטיגן הצגת תאים דנדריטים 4,7,8. תאים אלו מוקפים בשכבת תאים אפיתל intercalated עם M-התאים אשר אחראים אחזור אנטיגן מן המשטחים הריריים של מעברי האוויר 9,10. לימפוציטים נאיביים במחזור דרך NALT עומדים להגיב על המפגשים הראשונים עם גורמי מחלה בדרכי הנשימה 7. בעוד NALT נעלמים אצל בני אדם עד גיל שנתיים, טבעת ומובנית דומה של Waldeyer הלימפה לאיברים להמשיך להתמיד הroughout חיים 6. בניגוד לבני אדם, עכברים לשמור NALT לאורך כל החיים, ובכך לספק מודל חיה נוח לחקר המערכת החיסונית שמקורם בתוך הסינוסים האף 11.
תרבויות של תא יחיד המתלים של NALT לא מעשית בשל תשואות נמוכות של תאים mononuclear. עם זאת, ביולוגיה NALT ניתן לבדוק על ידי culturing vivo לשעבר של איבר שלם, בשיטה זו יש יתרון נוסף של שמירה על הרקמה הטבעית. עבור במחקרים vivo, מודלים בנוקאאוט הצגת פגמים גנטיים מוגבל NALT לא זמין כרגע בשל הבנה לקויה של מסלול ההתפתחות. לדוגמה, בעוד lymphotoxin למוצרי אלפא עכברים בנוקאאוט התנוון NALT, תיקונים של Peyer, בלוטות לימפה הפריפריה, דנדריטים ותאי זקיקי הלימפה ורקמות אחרות שינו גם אלה מניפולציות גנטיות בעכברים 12,13. כחלופה עכברים בנוקאאוט גנים, עמ 'אבלציה כירורגיתermanently מבטלת NALT מן המעבר באף מבלי לפגוע ברקמות אחרות. מודל העכבר וכתוצאה מכך נעשה שימוש כדי ליצור קשרים בין התגובות NALT ו החיסונית לחיסונים 1,3. אוסף סדרתי של נסיוב, רוק, שטיפות האף הפרשות הנרתיק הכרחי להקמת בסיס של תגובות מארחים את החיסון, תוך כדי התגובה החיסונית שמקורם ישירות NALT שניתן לאשר על ידי תרביות רקמה. ההליכים הבאים מתארים את הניתוחים, תרבות רקמות ואיסוף המדגם יש לבחון מקומיים מערכתית התגובה החיסונית לחיסון הלחות (IN) אפי.
הצגנו שיטות קולקטיביות על פיתוח מודל החיה, קבלת דגימות ביולוגיות, מבחני לבחינת NALT הקשורים התגובה החיסונית 1-4. ישנם גורמים נוספים שיש להביא בחשבון בעת ביצוע שיטות אלה. טכניקות סטנדרטיות סטריליים לניתוח ותרבות רקמה יש ללכת. שילוב של סוכנים אנטיבקטריאלי נגד פטריות שימוש במהלך הבידוד ותרבות, כמו גם שמירה על מכשירים מעוקרים, אזור העבודה, ואת חיך מחוטאות תפחית את הסיכון של זיהום. בדיקת הרוק, האף דומים דגימות הפרשת הריריות יש לבדוק על אפשרות של זיהום בדם, כמו נוגדנים בסרום נמצאים בדרך כלל בריכוזים גבוהים יותר. יתר על כן, ההפרשות הריריות צריך רק להיות מדולל במעט לניתוח כי ריכוזים נמוכים יותר של נוגדנים נמצאים דגימות אלה לעומת בסרום.
עכברים יש לשמור על חם מיד לאחר הניתוח מראשלפרוק היפותרמיה הנגרמת הפוטנציאל הרדמה. עכברים מנוחה לסירוגין משני שלהם במהלך ההחלמה שלאחר הניתוח כדי למזער נשימה סדירה. ניתוח יעיל יותר עם שלושה אנשים עובדים יחד כדי להשלים את המשימות הבאות: 1 ביצוע הניתוח, 1 כדי לסייע מחזיק את הפה פתוח, ואחד לספק לאחר ניתוח טיפול כמו העכברים להתאושש מן ההרדמה.
יש צורך להשתמש ב H & E מכתים של חתכים הגולגולת בסוף כל ההליכים או מחקרים ניסויים כדי לוודא את הצלחת הניתוח על כל עכבר. ניתוח התוצאות האפשריות הן: אבלציה NALT מלא בין שתי המדינות, אבלציה שלם, או NALT ללא פגע. מאחר שלא כל הניתוחים תגרום לאובדן מוחלט של NALT, בעלי חיים עם NALT שיורית או תמים יכול לשמש הבקרה הפנימית. תוצאה נוספת היא כי הפוטנציאל החיך לא מצליח לרפא לחלוטין, משאיר פתח המחבר בין האף לבין הפה עששת. לא מושלםהריפוי של החיך תגרום משקל נמוך וכישלון לשגשג, אלה אנשים יש להסיר מחקרים.
בחינת התגובות החיסון הראשון עם מודל העכבר ישמש להקמת תפקיד NALT בתוצאות המחקר המיועד (תגובת נוגדנים, הישרדות וכו '). הסרה בניתוח של NALT מאפשר קביעת תרומות באף חסינות מקומית ומערכתית. הגישה הכירורגית המתוארת כאן היא השיטה הישירה ביותר להשגת במודל עכבר ללא NALT. בחר לדפוק הקצוב מודלים העכבר דווחו NALT חוסר, אבל החיות הללו הם גם חסר ציטוקינים או כמוקינים החיוניים להתפתחות רקמות הלימפה משניים אחרים, ועלול להכיל פגמים נוספים 12,13. יתר על כן, השיטות המתוארות כאן פותחו לבחינת היבטים שונים של התגובה החיסונית שמקורם בתוך מעברי האף. תוצאות הניסוי שלנו מבוססים על מחקרים באמצעות palat העליון כולוהדואר של העכבר על תרביות רקמה, אם כי יתכן כי ניתן יהיה להשתמש בחלקים. לבסוף, המודל NALT תרבותי שימושי לביצוע ניסויים לחלוטין בתרבות רקמות.
The authors have nothing to disclose.
תמיכה סופק על ידי בקטון דיקינסון טכנולוגיות. הדעות המובאות הגשת זה הם אלה של הכותבים ואינם מתיימרים לשקף את המדיניות הרשמית של ממשלת ארה"ב. המחקר נערך בהתאם לחוק לרווחת בעלי חיים וכן חוקים ותקנות פדרליים אחרים הקשורים בחיות וניסויים מעורבים בעלי חיים ועקרונות האמורים מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, המועצה הלאומית למחקר, 1996. המתקן שבו המחקר נערך באופן מלא הוא מוכר על ידי האגודה הערכת הסמכה של מעבדה בעלי חיים טיפול הבינלאומי.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Stainless Steel Sterile Surgical Blades, No. 11 | Miltex | 4-311 | |
Knife Handle, No. 3 | Miltex | 4-7 | |
48-well Cell Culture Plates | Costar | 3548 | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Gibco/Invitrogen | 16000-044 | Final Conc: 10% by volume in culture media |
Streptomycin Sulfate | Sigma | S9137 | Final Conc: 100 μg/mL |
Penicillin | Sigma | P7794 | Final Conc: 100 UI/mL |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | Final Conc: 50 μg/mL |
Fungizone | Gibco/Invitrogen | 15290-018 | Final Conc: 1 μg/mL |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Conc: 10 mM |
Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022364111 | |
Nutra-gel Cherry Flavored Mouse Wet Food | Bio-Serve | S4798-TRAY | |
Metacam | Boehringer Ingelheim | 601531000 | One drop of 1.5 mg/mL Oral Suspension |
Ketamine | Pfizer | 00856440301 | Final Conc: 6.06 mg/mL |
Acepromazine | Vedco | VEDC207 | Final Conc: 0.061 mg/mL |
Xylazine | Lloyd | 4811 | Final Conc: 0.667 mg/mL |
Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | 1621 | |
0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter | 2B1302 | |
0.5 mm Microcurette | Roboz | RS-6350 | |
Thermal Cautery Unit | Geiger | 150-S/150A-S | |
TCU Replacement Tip, Straight Fine Loop | Geiger | 214 | |
Surgical Scissors | |||
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma | HT501128 | |
Formic Acid | Fisher | A119P-4 | Mix 426 mL formic acid into 1047 mL tap water, then add 45 mL Rexyn 101 (H) |
Rexyn 101 (H) | Fisher | R231-500 | |
Tissue-Tek VIP E150/E300 | Sakura | ||
Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
Mayer’s Hematoxylin | Sigma | MHS16-500ML | |
Gill No.1 Hematoxylin | Sigma | GHS116 | |
Eosin B | Sigma | 2853 | |
Microtainer Serum Separator | BD Medical | 365956 | |
Phosphate Buffered Saline | 100 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4 | ||
Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free | Thermo Scientific | 78415 |