Métodos para examinar las contribuciones de los tejidos nasofaríngeos linforreticulares-asociados (NALT) a la respuesta inmune sistémica nasales y de los ratones a las vacunas intranasales se describen. Se demuestra un procedimiento quirúrgico para establecer un modelo de ratón NALT-dependiente y<em> Ex vivo</em> Culturas de NALT extraídos.
Los tejidos de la nasofaringe linforreticulares-asociados (NALT) que se encuentran en los seres humanos, roedores y otros mamíferos, contribuyen a la inmunidad en los senos nasales 1-3. El NALT dos paralelas en forma de campana estructuras localizadas en las fosas nasales por encima del paladar duro, y generalmente se considera que los componentes secundarios del sistema linfoide asociado a las mucosas 4-6. Situado dentro del NALT son compartimentos discretos de linfocitos B y T intercaladas con células presentadoras de antígeno dendríticas 4,7,8. Estas células están rodeadas por una capa de células epiteliales intercaladas con M-células que son responsables de la recuperación de antígenos de las superficies mucosas de los conductos de aire 9,10. Naive linfocitos que circulan a través de la NALT están preparados para responder a los primeros encuentros con patógenos respiratorios 7. Mientras que NALT desaparecen en los seres humanos a la edad de dos años, los órganos del anillo de Waldeyer y estructurado de manera similar linfáticos persisten ºroughout la vida 6. En contraste con los humanos, ratones retener NALT durante toda la vida, proporcionando así un modelo animal conveniente para el estudio de las respuestas inmunes originarios dentro de los senos nasales 11.
Los cultivos de una sola célula de suspensiones de NALT no son prácticos debido a los bajos rendimientos de células mononucleares. Sin embargo, la biología NALT pueden ser examinadas mediante el cultivo ex vivo del órgano intacto, y este método tiene la ventaja adicional de mantener la estructura de tejido natural. Para los estudios in vivo, los modelos genéticos knock-out que presentan defectos limitados a NALT no están disponibles en la actualidad, debido a una mala comprensión de la vía de desarrollo. Por ejemplo, mientras que la linfotoxina-alfa ratones knock-out se han atrofiado NALT, las placas de Peyer, ganglios linfáticos periféricos, las células dendríticas foliculares y otros tejidos linfoides también se alteran en estos ratones genéticamente manipulados 12,13. Como una alternativa a los ratones knockout de genes, p ablación quirúrgicaermanently elimina NALT de la fosa nasal, sin afectar otros tejidos. El modelo de ratón resultante se ha utilizado para establecer relaciones entre las respuestas NALT e inmune a las vacunas 1,3. Recolección de serie del suero, saliva, lavados nasales y secreciones vaginales es necesaria para establecer la base de las respuestas del huésped a la vacunación, mientras que las respuestas inmunes procedentes directamente de NALT se puede confirmar mediante cultivo de tejidos. Los procedimientos siguientes se describen las intervenciones quirúrgicas, cultivo de tejidos y toma de muestras necesarias para examinar locales y sistémicos respuesta inmune humoral a intranasal (IN) la vacunación.
Hemos presentado los métodos colectivos para el desarrollo de un modelo animal, la obtención de muestras biológicas, y los ensayos para el examen de NALT asociados a la respuesta inmune 1-4. Hay factores adicionales a tener en cuenta durante la realización de estos métodos. Norma técnicas estériles para cirugía y cultivo de tejidos deben ser seguidas. Una combinación de agentes antibacterianos y antifúngicos utilizados durante el aislamiento y cultivo, así como el mantenimiento de los instrumentos esterilizados, área de trabajo y paladares desinfectadas se reduce el riesgo de contaminación. La saliva, lavados nasales y similares muestras de la secreción de la mucosa debe ser inspeccionado por la posible contaminación con sangre, como los anticuerpos en suero se encuentran generalmente en concentraciones más altas. Además, las secreciones mucosas sólo debe ser ligeramente diluido para el análisis porque concentraciones más bajas de anticuerpos están presentes en estas muestras en comparación con el suero.
Los ratones deben mantenerse caliente directamente después de la cirugía previaventilar potencial de la anestesia inducida por la hipotermia. Alterne los ratones de descanso en sus caras durante la recuperación después de la cirugía para reducir al mínimo la respiración irregular. El procedimiento quirúrgico es más eficaz con tres individuos que trabajan juntos para completar estas tareas: una realización de la cirugía, uno para ayudar a mantener la boca abierta, y para proporcionar una atención postquirúrgica, como los ratones a recuperarse de la anestesia.
Es necesario el uso de la tinción H & E de las secciones transversales del cráneo al final de todos los procedimientos experimentales o estudios para verificar el éxito de la cirugía para cada ratón. Posibles resultados de cirugía son: la ablación completa NALT y bilaterales, la ablación incompleta, o NALT intacto. Debido a que no todas las cirugías se traducirá en una pérdida completa de la NALT, los animales con NALT residual o intacta puede ser utilizado como controles internos. Otro posible resultado es que el paladar no se cura por completo, dejando una abertura que conecta el nasal y la cavidad bucal. Incompletola curación del paladar dará lugar a su bajo peso y retraso del crecimiento, y que deberán ser retirados de los estudios.
Al examinar las respuestas de la vacuna en primer lugar con el modelo de ratón servirá para establecer el papel de NALT en el resultado del estudio previsto (respuesta de anticuerpos, la supervivencia, etc.) La extirpación quirúrgica de la NALT facilita la determinación de las contribuciones nasales a la inmunidad local y sistémica. El abordaje quirúrgico se describe aquí es el método más directo para la obtención de un modelo de ratón carente de NALT. Seleccione knock-out modelos de ratón han sido reportados a NALT la falta, pero estos animales también son deficientes en citocinas o quimiocinas esenciales para el desarrollo de otros tejidos linfoides secundarios, y pueden albergar otros defectos 12,13. Además, los métodos descritos aquí se han desarrollado para examinar varios aspectos de la respuesta inmune se originan dentro de los conductos nasales. Los resultados experimentales se basan en estudios que utilizan el Palat toda la parte superiore desde el ratón para cultivo de tejidos, aunque es posible que las secciones pueden ser utilizados. Finalmente, el modelo NALT cultivadas es útil para realizar experimentos completamente en cultivo de tejidos.
The authors have nothing to disclose.
Se prestó apoyo por Becton Dickinson Tecnologías. Las opiniones expresadas en esta presentación son las de los autores y no pretenden reflejar la política oficial del Gobierno de los EE.UU.. La investigación fue realizada en cumplimiento de la Ley de Bienestar Animal y otras leyes federales y reglamentos relativos a los animales y los experimentos con animales y se adhiere a los principios establecidos en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, Consejo Nacional de Investigación, 1996. La instalación donde se llevó a cabo esta investigación está totalmente acreditado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Stainless Steel Sterile Surgical Blades, No. 11 | Miltex | 4-311 | |
Knife Handle, No. 3 | Miltex | 4-7 | |
48-well Cell Culture Plates | Costar | 3548 | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Gibco/Invitrogen | 16000-044 | Final Conc: 10% by volume in culture media |
Streptomycin Sulfate | Sigma | S9137 | Final Conc: 100 μg/mL |
Penicillin | Sigma | P7794 | Final Conc: 100 UI/mL |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | Final Conc: 50 μg/mL |
Fungizone | Gibco/Invitrogen | 15290-018 | Final Conc: 1 μg/mL |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Conc: 10 mM |
Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022364111 | |
Nutra-gel Cherry Flavored Mouse Wet Food | Bio-Serve | S4798-TRAY | |
Metacam | Boehringer Ingelheim | 601531000 | One drop of 1.5 mg/mL Oral Suspension |
Ketamine | Pfizer | 00856440301 | Final Conc: 6.06 mg/mL |
Acepromazine | Vedco | VEDC207 | Final Conc: 0.061 mg/mL |
Xylazine | Lloyd | 4811 | Final Conc: 0.667 mg/mL |
Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | 1621 | |
0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter | 2B1302 | |
0.5 mm Microcurette | Roboz | RS-6350 | |
Thermal Cautery Unit | Geiger | 150-S/150A-S | |
TCU Replacement Tip, Straight Fine Loop | Geiger | 214 | |
Surgical Scissors | |||
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma | HT501128 | |
Formic Acid | Fisher | A119P-4 | Mix 426 mL formic acid into 1047 mL tap water, then add 45 mL Rexyn 101 (H) |
Rexyn 101 (H) | Fisher | R231-500 | |
Tissue-Tek VIP E150/E300 | Sakura | ||
Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
Mayer’s Hematoxylin | Sigma | MHS16-500ML | |
Gill No.1 Hematoxylin | Sigma | GHS116 | |
Eosin B | Sigma | 2853 | |
Microtainer Serum Separator | BD Medical | 365956 | |
Phosphate Buffered Saline | 100 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4 | ||
Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free | Thermo Scientific | 78415 |