وصفت وسائل لدراسة مساهمات للأنسجة البلعوم المرتبط اللمفي (NALT) إلى الاستجابات المناعية الأنف والنظامية من الفئران لقاحات داخل الأنف. علينا أن نبرهن لعملية جراحية لوضع نموذج الفأر NALT التي تعتمد على و<em> خارج الحي</em> ثقافات NALT المستخرجة.
أنسجة البلعوم المرتبط اللمفي (NALT) وجدت في البشر، والقوارض، وغيرها من الثدييات، والمساهمة في الحصانة في الجيوب الأنفية 1-3. وNALT هما مواز على شكل جرس الهياكل الموجودة في الممرات الأنفية فوق الحنك الصلب، وعادة ما تعتبر أن تكون المكونات الثانوية للنظام المخاطية المرتبطة اللمفاوية و 4-6. تقع داخل NALT هي مقصورات منفصلة من الخلايا الليمفاوية B و T تتخللها مستضد تقديم الخلايا الجذعية 4،7،8. وتحاط هذه الخلايا من قبل طبقة الخلايا الظهارية مقحم مع M-الخلايا التي هي المسؤولة عن استرجاع مستضد من الأسطح المخاطية في الممرات الجوية 9،10. تستعد الخلايا الليمفاوية ساذج المتداولة خلال NALT للرد على اللقاءات الأولى مع مسببات الأمراض التنفسية 7. في حين NALT تختفي في البشر قبل سن سنتين، أجهزة فالداير اللمفاوي الطوق ومنظم على نحو مماثل لا تزال قائمة الroughout الحياة 6. وعلى النقيض من البشر والفئران الاحتفاظ NALT في جميع مراحل الحياة، وبالتالي توفير نموذج حيواني مناسب لدراسة الاستجابات المناعية تنشأ داخل الجيوب الأنفية 11.
ثقافات وحيدة الخلية تعليق من NALT ليست عملية بسبب العائدات المنخفضة من خلايا وحيدات النوى. ومع ذلك، يمكن النظر NALT البيولوجيا بواسطة استزراع الأحياء السابقين من الجهاز سليمة، وهذا الأسلوب له ميزة إضافية للحفاظ على بنية الأنسجة الطبيعية. لفي الدراسات المجراة، ونماذج خروج المغلوب الوراثية تقديم العيوب تقتصر على NALT غير متوفرة حاليا بسبب وجود سوء فهم من المسار التنموي. على سبيل المثال، في حين سم لمفي-α الفئران خروج المغلوب وقد ضمر NALT، تتغير أيضا البقع باير، والعقد اللمفاوية الطرفية، والخلايا الجذعية والأنسجة اللمفاوية مسامي الأخرى في هذه الفئران التلاعب وراثيا 12،13. كبديل عن الفئران خروج المغلوب الجينات، والعمليات الجراحية ص الاجتثاثيلغي ermanently NALT من ممر الأنف دون أن يؤثر ذلك الأنسجة الأخرى. وقد استخدم نموذج الفأر مما أدى إلى إقامة علاقات بين استجابات NALT والمناعية للقاحات 1،3. جمع المسلسل من مصل الدم، ويغسل، لعاب الانف والافرازات المهبلية هو ضروري لوضع الأساس للاستجابات المضيف إلى تلقيح، في حين يمكن التأكد من الاستجابات المناعية المنشأ مباشرة من NALT بواسطة زراعة الأنسجة. الإجراءات التالية الخطوط العريضة لعملية جراحية، وزراعة الأنسجة وجمع العينات اللازمة لفحص المحلية والنظامية الاستجابات المناعية الخلطية للتلقيح (IN) داخل الأنف.
قدمنا وسائل جماعية لتطوير نموذج حيواني، والحصول على العينات البيولوجية، وفحوصات لدراسة NALT المرتبطة الاستجابات المناعية 1-4. هناك عوامل إضافية للنظر في أثناء أداء هذه الأساليب. وينبغي اتباع الأساليب العقيمة معيار للجراحة وزراعة الأنسجة. وهناك مجموعة من العوامل المضادة للبكتيريا ومضاد للفطريات التي استخدمت خلال العزلة والثقافة، فضلا عن الحفاظ على الآلات المعقمة، مجال العمل، والأذواق تطهيرها لحد من مخاطر التلوث. وينبغي أن يتم فحص اللعاب، ويغسل الأنف وعينات مماثلة إفراز المخاطية للتلوث محتمل مع الدم، كما تم العثور على أضداد المصل بشكل عام في تركيزات أعلى. كذلك، يجب فقط الافرازات المخاطية أن تضعف قليلا لتحليل لتركيزات أقل من الأجسام المضادة موجودة في هذه العينات بالمقارنة مع المصل.
يجب أن تبقى الفئران دافئ مباشرة بعد عملية جراحية لمرحلة ما قبلتنفيس عن إمكانية التخدير التي يسببها انخفاض حرارة الجسم. الفئران بديل يستريح على جنوبهم أثناء النقاهة بعد الجراحة لتقليل تنفس غير منتظم. الإجراء الجراحي هو أكثر كفاءة مع ثلاثة أشخاص يعملون معا لإتمام هذه المهام: 1 أداء عملية جراحية، واحدة للمساعدة في عقد فتح الفم، واحد لتوفير الرعاية بعد العمليات الجراحية مثل الفئران على التعافي من التخدير.
فمن الضروري استخدام H & E تلطيخ من المقاطع عبر الجمجمة في نهاية كل الإجراءات التجريبية أو دراسات للتحقق من نجاح عملية جراحية لكل فأر. نتائج الجراحة ممكنة هي: الكامل والثنائية الاجتثاث NALT، الاجتثاث غير مكتملة، أو NALT سليمة. ويمكن استخدام ذلك لأن ليس كل العمليات الجراحية سوف يؤدي إلى فقدان كامل للNALT والحيوانات مع NALT المتبقية أو سليمة والضوابط الداخلية. آخر النتائج المحتملة هو أن الحنك فشل للشفاء تماما، وترك فتحة توصيل الأنف والتجاويف عن طريق الفم. غير كاملوالشفاء من الحنك يؤدي إلى انخفاض الوزن وعدم قدرته على النمو، ويجب إزالة هؤلاء الأفراد من الدراسات.
وسوف تدرس الردود اللقاح الأول مع نموذج الفأر تعمل على إنشاء دور للNALT في نتائج الدراسة المقصود (استجابة الأجسام المضادة، والبقاء على قيد الحياة، وما إلى ذلك). جراحيا إزالة NALT يسهل تحديد الاشتراكات الأنف لحصانة المحلية والنظامية. النهج الجراحية وصفها هنا هو الأسلوب الأكثر مباشرة للحصول على نموذج الفأر تخلو من NALT. حدد بنظام خروج المغلوب وقد أبلغ عن نماذج الماوس إلى NALT نقص، ولكن هذه الحيوانات هي أيضا من نقص في السيتوكينات أو كيموكينات أساسي في تطوير الأنسجة الأخرى اللمفاوية الثانوية، ويمكن أن تؤوي عيوب إضافية 12،13. علاوة على ذلك، تم تطوير أساليب وصفها هنا لدراسة جوانب عديدة من الاستجابات المناعية تنشأ داخل الممرات الأنفية. وتستند النتائج التي حققناها في دراسات تجريبية باستخدام كامل الحنك العلويه من الماوس لزراعة الأنسجة، على الرغم من أنه من الممكن أن يمكن استخدام المقاطع. أخيرا، فإن النموذج NALT مثقف مفيد لإجراء التجارب تماما في زراعة الأنسجة.
The authors have nothing to disclose.
وقدم الدعم من قبل تقنيات بيكتون ديكنسون. الآراء الواردة في هذا البيان هي آراء المؤلفين ولا تدعي لتعكس السياسة الرسمية للحكومة الولايات المتحدة. وقد أجريت بحوث في الامتثال لقانون رعاية الحيوان والقوانين الاتحادية واللوائح الأخرى المتعلقة الحيوانات والتجارب التي تنطوي على الحيوانات ويلتزم المبادئ المنصوص عليها في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، المجلس القومي للبحوث، عام 1996. وتماما المعتمدين منشأة حيث تم إجراء هذا البحث من قبل جمعية تقويم والاعتماد من المنظمة الدولية لرعاية الحيوان المعملية.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Stainless Steel Sterile Surgical Blades, No. 11 | Miltex | 4-311 | |
Knife Handle, No. 3 | Miltex | 4-7 | |
48-well Cell Culture Plates | Costar | 3548 | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Gibco/Invitrogen | 16000-044 | Final Conc: 10% by volume in culture media |
Streptomycin Sulfate | Sigma | S9137 | Final Conc: 100 μg/mL |
Penicillin | Sigma | P7794 | Final Conc: 100 UI/mL |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | Final Conc: 50 μg/mL |
Fungizone | Gibco/Invitrogen | 15290-018 | Final Conc: 1 μg/mL |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Conc: 10 mM |
Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022364111 | |
Nutra-gel Cherry Flavored Mouse Wet Food | Bio-Serve | S4798-TRAY | |
Metacam | Boehringer Ingelheim | 601531000 | One drop of 1.5 mg/mL Oral Suspension |
Ketamine | Pfizer | 00856440301 | Final Conc: 6.06 mg/mL |
Acepromazine | Vedco | VEDC207 | Final Conc: 0.061 mg/mL |
Xylazine | Lloyd | 4811 | Final Conc: 0.667 mg/mL |
Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | 1621 | |
0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter | 2B1302 | |
0.5 mm Microcurette | Roboz | RS-6350 | |
Thermal Cautery Unit | Geiger | 150-S/150A-S | |
TCU Replacement Tip, Straight Fine Loop | Geiger | 214 | |
Surgical Scissors | |||
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma | HT501128 | |
Formic Acid | Fisher | A119P-4 | Mix 426 mL formic acid into 1047 mL tap water, then add 45 mL Rexyn 101 (H) |
Rexyn 101 (H) | Fisher | R231-500 | |
Tissue-Tek VIP E150/E300 | Sakura | ||
Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
Mayer’s Hematoxylin | Sigma | MHS16-500ML | |
Gill No.1 Hematoxylin | Sigma | GHS116 | |
Eosin B | Sigma | 2853 | |
Microtainer Serum Separator | BD Medical | 365956 | |
Phosphate Buffered Saline | 100 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4 | ||
Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free | Thermo Scientific | 78415 |