Methoden om bijdragen van de nasofaryngeale-geassocieerde lymforeticulaire weefsels (nalt) naar neus-en systemische immuunrespons van muizen voor intranasale vaccins te onderzoeken beschreven. We tonen een chirurgische ingreep om een nalt-afhankelijke muis model vast te stellen en<em> Ex vivo</em> Culturen van gewonnen nalt.
De nasopharyngeal-geassocieerde lymforeticulaire weefsels (nalt) gevonden worden bij mensen, knaagdieren en andere zoogdieren, bijdragen aan de immuniteit in de nasale sinussen 1-3. De nalt zijn twee parallelle klok-vormige structuren in de neus boven het harde gehemelte, en worden meestal beschouwd als secundaire componenten van het mucosale-geassocieerde lymfoïde systeem 4-6. Ligt in het nalt zijn discrete compartimenten van B en T-lymfocyten afgewisseld met antigeen-presenterende dendritische cellen 4,7,8. Deze cellen zijn omgeven door een epitheelcellen laag geïntercaleerd met M-cellen die verantwoordelijk zijn voor antigenen van de slijmvliezen van de luchtwegen 9,10. Naïeve lymfocyten circuleren door het nalt zijn klaar om de eerste ontmoetingen reageren met respiratoire pathogenen 7. Terwijl nalt verdwijnen bij de mens door de leeftijd van twee jaar, de Waldeyer de Ring en op soortgelijke wijze gestructureerde lymfatische organen blijven ste blijven bestaanroughout leven 6. In tegenstelling tot mensen, muizen behouden nalt gedurende het hele leven, en zo een handige diermodel voor de studie van de immuunrespons van oorsprong uit de neusbijholten 11.
Cultures van enkele-celsuspensies van nalt niet praktisch vanwege de lage opbrengst van mononucleaire cellen. Echter, nalt biologie worden onderzocht door ex vivo kweken van de intacte orgaan, en deze methode heeft het bijkomende voordeel van behoud van de natuurlijke weefselstructuur. Voor de in vivo studies, genetische knock-out modellen presenteren gebreken beperkt tot nalt zijn momenteel niet beschikbaar als gevolg van een slecht begrip van de ontwikkeling pad. Bijvoorbeeld, terwijl lymfotoxine-α knockout muizen afgestorven nalt worden de plaques van Peyer, perifere lymfknopen, folliculaire dendritische cellen en andere lymfoïde weefsel ook veranderd in deze genetisch gemanipuleerde muizen 12,13. Als alternatief voor de knockout muizen, chirurgische ablatie permanently elimineert nalt uit de neusholte, zonder dat andere weefsels. De resulterende muis model is gebruikt om de relaties tussen nalt en de immuunrespons op vaccins 1,3 vast te stellen. Serial verzameling van het serum, speeksel, neus wast en vaginale afscheiding is nodig voor het vaststellen van de hand van gastheer responsen tegen vaccinatie, terwijl de immuunrespons rechtstreeks afkomstig nalt kan worden bevestigd door weefselkweek. De volgende procedures een overzicht van de operaties, weefselkweek en monstername nodig is om lokale en systemische humorale immuunrespons op intranasale (IN) vaccinatie te onderzoeken.
We hebben gepresenteerd collectieve methoden voor het ontwikkelen van een diermodel, het verkrijgen van biologische monsters en testen voor de behandeling van nalt-geassocieerde immuunreacties 1-4. Er zijn bijkomende factoren te overwegen tijdens de uitvoering van deze methoden. Standaard steriele technieken voor de operatie en weefselkweek moeten worden opgevolgd. Een combinatie van antibacteriële en schimmelwerende middelen die worden gebruikt tijdens de isolatie en cultuur, alsmede het onderhouden van gesteriliseerde instrumenten, het werkgebied, en ontsmet fijnproevers zullen verminderen het risico op besmetting. Speeksel, nasale wast en soortgelijke mucosale secretie monsters moeten worden gecontroleerd op mogelijke besmetting met bloed, als serum-antilichamen worden over het algemeen te vinden in hogere concentraties. Verder moet mucosale afscheiding slechts licht verdund analyse door lagere concentraties van antilichamen aanwezig in deze monsters opzichte van serum.
Muizen moeten warm gehouden worden direct na de operatie aan voorafraat helpt mogelijke anesthesie-geïnduceerde hypothermie. Alternate rust muizen op hun kant tijdens post-operatie recuperatie om onregelmatige ademhaling te minimaliseren. De chirurgische ingreep is efficiënter met drie personen samen te werken om deze taken uit te voeren: een uitvoering van de operatie, een om te helpen bij houden van de mond open, en een voor post-operatieve zorg te verlenen als de muizen te herstellen van anesthesie.
Het is noodzakelijk H & E kleuring van hersen doorsneden gebruikt eind alle experimentele procedures of studies het succes van de operatie voor elke muis verifiëren. Mogelijke operatie resultaten zijn: compleet en bilaterale nalt ablatie, onvolledige ablatie, of intacte nalt. Omdat niet alle operaties leidt volledig verlies van de nalt dieren met resterende intacte of nalt kan worden gebruikt als controle. Een ander potentieel resultaat is dat de mond niet volledig genezen, waardoor een opening aansluiten van de neus en de orale holten. Onvollediggenezing van het gehemelte zal resulteren in een laag gewicht en het nalaten te bloeien, en deze mensen moeten worden verwijderd uit studies.
Onderzoek vaccin responsen eerst met muismodel dienen om een rol nalt stellen in het beoogde resultaat studie (antilichaamrespons overleving, etc.). Operatieve verwijdering van de nalt vergemakkelijkt het bepalen van de neus bijdragen aan de lokale en systemische immuniteit. De chirurgische aanpak die hier beschreven is de meest directe methode voor het verkrijgen van een muis model zonder nalt. Selecteer knock-out muismodellen zijn gemeld aan een gebrek nalt, maar deze dieren ook een tekort aan cytokinen of chemokinen essentieel voor de ontwikkeling van andere secundaire lymfoïde weefsels, en zij kunnen drager extra defecten 12,13. Verder werden de hier beschreven methoden ontwikkeld voor de behandeling van verschillende aspecten van de immuunrespons van oorsprong uit de neus. Onze experimentele resultaten zijn gebaseerd op studies met behulp van de gehele bovenste palate van de muis weefselkweek, hoewel het mogelijk dat delen worden gebruikt. Ten slotte gekweekte nalt model is nuttig voor het uitvoeren van proeven geheel in weefselkweek.
The authors have nothing to disclose.
Ondersteuning werd geleverd door Becton Dickinson Technologies. Standpunten in dit indiening zijn die van de auteurs en geven niet de bedoeling om het officiële beleid van de Amerikaanse overheid te geven. Onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met de Animal Welfare Act en andere federale statuten en reglementen met betrekking tot dieren en experimenten met dieren en houdt zich aan principes vermeld in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren, National Research Council, 1996. De faciliteit waar dit onderzoek werd uitgevoerd is geaccrediteerd volledig door de Vereniging voor evaluatie en accreditatie van het laboratorium Animal Care International.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Stainless Steel Sterile Surgical Blades, No. 11 | Miltex | 4-311 | |
Knife Handle, No. 3 | Miltex | 4-7 | |
48-well Cell Culture Plates | Costar | 3548 | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Gibco/Invitrogen | 16000-044 | Final Conc: 10% by volume in culture media |
Streptomycin Sulfate | Sigma | S9137 | Final Conc: 100 μg/mL |
Penicillin | Sigma | P7794 | Final Conc: 100 UI/mL |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | Final Conc: 50 μg/mL |
Fungizone | Gibco/Invitrogen | 15290-018 | Final Conc: 1 μg/mL |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Conc: 10 mM |
Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022364111 | |
Nutra-gel Cherry Flavored Mouse Wet Food | Bio-Serve | S4798-TRAY | |
Metacam | Boehringer Ingelheim | 601531000 | One drop of 1.5 mg/mL Oral Suspension |
Ketamine | Pfizer | 00856440301 | Final Conc: 6.06 mg/mL |
Acepromazine | Vedco | VEDC207 | Final Conc: 0.061 mg/mL |
Xylazine | Lloyd | 4811 | Final Conc: 0.667 mg/mL |
Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | 1621 | |
0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter | 2B1302 | |
0.5 mm Microcurette | Roboz | RS-6350 | |
Thermal Cautery Unit | Geiger | 150-S/150A-S | |
TCU Replacement Tip, Straight Fine Loop | Geiger | 214 | |
Surgical Scissors | |||
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma | HT501128 | |
Formic Acid | Fisher | A119P-4 | Mix 426 mL formic acid into 1047 mL tap water, then add 45 mL Rexyn 101 (H) |
Rexyn 101 (H) | Fisher | R231-500 | |
Tissue-Tek VIP E150/E300 | Sakura | ||
Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
Mayer’s Hematoxylin | Sigma | MHS16-500ML | |
Gill No.1 Hematoxylin | Sigma | GHS116 | |
Eosin B | Sigma | 2853 | |
Microtainer Serum Separator | BD Medical | 365956 | |
Phosphate Buffered Saline | 100 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4 | ||
Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free | Thermo Scientific | 78415 |