Summary

La generación de células T reguladoras inducidas de células humanas primarias T vírgenes y de memoria

Published: April 16, 2012
doi:

Summary

Se describe un método para la generación de regulación, la memoria y el ingenuo células T de un donante de sangre humana única. Polarizada Tregs puede ser entonces en comparación con otros subconjuntos en una variedad de aplicaciones genéticas y funcionales con homogeneidad genética, incluyendo un ensayo de supresión también detallan aquí.

Abstract

El desarrollo y mantenimiento de las células CD4 + inmunosupresores células T reguladoras (Tregs) contribuir a la tolerancia periférica necesaria para permanecer en homeostasis inmunológica con la gran cantidad de antígenos propios y comensales en y sobre el cuerpo humano. Las perturbaciones en el equilibrio entre las células T reguladoras y células T inflamatorias convencionales puede resultar en la inmunopatología o el cáncer. Aunque la inyección terapéutica de Tregs ha demostrado ser eficaz en modelos murinos de la colitis 1, diabetes tipo I 2, la artritis reumatoide y enfermedad de injerto contra huésped, 4 varias diferencias fundamentales en humanos versus ratón TREG biología 5 hasta ahora ha impedido el uso clínico. La falta de número suficiente, la pureza, la estabilidad y la especificidad de recalada terapéutico Tregs necesaria una plataforma dinámica de desarrollo TREG humana en la que para optimizar las condiciones para su expansión ex vivo 6.

Aquí Describe un método para la diferenciación de las células T reguladoras inducidas (iTregs) a partir de un solo donante de sangre periférica humana que se puede dividir en cuatro etapas: el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica, la selección magnética de células T CD4 +, en el cultivo celular in vitro y activadas por fluorescencia clasificación de células (FACS) de subconjuntos de células T. Puesto que la transcripción TREG firma factor de forkhead P3 caja (FoxP3) es un factor de transcripción inducida por activación en los seres humanos 7 y ningún otro marcador único existe, un panel de combinatoria de marcadores debe ser utilizado para identificar las células T con actividad supresora. Después de seis días de cultivo, las células de nuestro sistema pueden ser demarcadas en las células T ingenuas, las células T de memoria o iTregs en función de su expresión relativa de CD25 y CD45RA. Mientras que las células T ingenuas de memoria y tienen diferentes informes sobre las necesidades de polarización y plasticidades 8, pre-clasificación de la población de células T inicial en CD45RA + y CD45RO + subconjuntos puede be utiliza para examinar estas discrepancias. De acuerdo con los demás, nuestra CD25 Hola CD45RA iTregs expresar altos niveles de FoxP3 9, GITR y CTLA 4-11 y bajos niveles de CD127 12. Tras FACS de cada población, las células resultantes pueden ser utilizados en un ensayo supresor que evalúa la capacidad relativa para retardar la proliferación de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE)-etiquetados células T autólogas.

Protocol

1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de capa leucocitaria Adquirir una unidad de la capa leucocitaria del hospital o las inmediaciones del centro de sangre. Nuestro banco de sangre nos da alrededor de 40-60 ml de la capa leucocitaria obtenida por unidad de donantes de sangre normales. Verter la sangre en un frasco de vidrio esterilizado 500 ml que contiene PBS estéril para diluir la capa leucocitaria. El volumen final de PBS + capa leucocitaria debe ser de 250 ml. <…

Discussion

Si bien la transferencia TREG es una gran promesa terapéutica para combatir el rechazo del injerto autoinmunidad y otros trastornos inmunes o inflamatorias mediadas, métodos para su generación eficiente y el mantenimiento estable todavía no se han desarrollado. Dado que sólo el 1-5% de la circulación de las células T son células T reguladoras, su expansión controlada y la diferenciación supera esta escasez como un importante elemento de disuasión de la aplicación de células T reguladoras en la clínica. Por…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

<p class="jove_content"> Los autores desean agradecer a Jennifer Strange y Bauman Greg por su ayuda con el análisis de citometría de flujo y clasificación. Este trabajo fue apoyado por el Número de Subvenciones del NIH 2P20 RR020171 de la CNRR y por la Universidad de Kentucky de los fondos de inicio de FM; GIE reconoce el apoyo de la Beca de Postgrado y la Beca Presidencial de Oportunidades de Kentucky.</p

Materials

Name of the reagent Company Catalogue Number Comments
Lymphoprep Axis-Shield 1114547 Keep at room temperature
Refrigerated Bench-Top Centrifuge Eppendorf 5810R  
Bright-Line Hemocytometer Hausser Scientific 3110  
EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19052  
EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19157  
EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19155  
The Big Easy EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18001 Silver
5 mL Round Bottom Polystyrene Tubes BD Falcon 352008  
15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes VWR 89004-368  
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tubes BD Falcon 352059  
50 mL Polypropylene Centrifuge Tubes VWR 89004-364  
Human anti-CD3 Antibody Bio X Cell BE0001-2 Clone: OKT3
24 Well Cell Polystyrene Culture Plate BD Falcon 353047  
96 Well Round Bottom Tissue Culture Plate Grenier Bio-One 650180  
RPMI 1640 with Glutamax-I and HEPES Buffer Gibco 72400  
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000  
β-Mercaptoethanol Sigma M7522  
Recombinant Human TGF-β1 eBioscience 14-8348-62  
Recombinant Human IL-2 eBioscience 14-8029-63  
Bovine Serum Albumin (BSA) MP Biomedicals Inc. 810531  
0.5 M EDTA Amresco E177  
Mouse Anti-Human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024 Clone: 4E3
Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 eBioscience 15-0458-42 Clone: HI100
Mouse Anti-Human CD127-APC Miltenyi Biotec 130-094-890 Clone: MB15-18C9
DNase II MP Biomedicals Inc. 190370  
MoFlo Flow Cytometer Beckman Coulter    
FlowJo Software Tree Star, Inc.    
Cell Quest Pro Software BD Biosciences    
Newborn Calf Serum Gibco 16010  
L-glutamine Gibco 25030  
AIM-V Gibco 0870112  
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Invitrogen C34554  
Treg Suppression Inspector Beads Miltenyi Biotec 130-092-909  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140  
40 μM Nylon Cell Strainer BD Falcon 352340  

References

  1. Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity. The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).
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Cite This Article
Ellis, G. I., Reneer, M. C., Vélez-Ortega, A. C., McCool, A., Martí, F. Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Naïve and Memory T Cells. J. Vis. Exp. (62), e3738, doi:10.3791/3738 (2012).

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