Summary

Génération de cellules T régulatrices induites de l'homme primaires cellules T naïves et mémoire

Published: April 16, 2012
doi:

Summary

Nous décrivons une méthode pour générer des cellules T régulatrices, de mémoire et naïve d'un donneur de sang humain unique. Polarisée Tregs peut être ensuite comparé à des sous-ensembles d'autres dans une variété d'applications génétiques et fonctionnelles avec une homogénéité génétique, y compris un test de suppression aussi détaillé ici.

Abstract

Le développement et la maintenance de CD4 + de immunosuppresseurs des cellules T régulatrices (Treg) contribuer à la tolérance périphérique nécessaire pour rester dans l'homéostasie immunologique avec la grande quantité des antigènes du soi et commensaux à l'intérieur et sur ​​le corps humain. Perturbations de l'équilibre entre Tregs et inflammatoires cellules T conventionnelles peuvent entraîner immunopathologie ou le cancer. Bien que l'injection thérapeutique des Treg a été démontré pour être efficace dans des modèles murins de la colite 1, diabète de type I 2, la polyarthrite rhumatoïde et maladie du greffon contre l'hôte, 4 plusieurs différences fondamentales dans l'homme par rapport à la souris Treg biologie 5 a jusqu'à présent empêché l'utilisation clinique. L'absence d'un nombre suffisant, la pureté, la stabilité et la spécificité de ralliement de la thérapeutique Tregs a nécessité une plate-forme dynamique de développement humain, sur laquelle Treg afin d'optimiser les conditions de leur expansion ex vivo 6.

Ici, nous D ÀEscribe une méthode pour la différenciation des lymphocytes T régulateurs induits (iTregs) à partir d'un seul donneur de sang périphérique humain qui peut être décomposé en quatre étapes: l'isolement de cellules mononucléées du sang périphérique, la sélection magnétique de cellules T CD4 +, dans la culture cellulaire in vitro et activé par fluorescence tri cellulaire (FACS) de sous-ensembles de lymphocytes T. Depuis la transcription Treg facteur de la signature P3 boîte de forkhead (FoxP3) est un facteur de transcription induite par activation chez les humains 7 et aucun autre marqueur unique existe, un panneau de combinatoire des marqueurs doit être utilisé pour identifier les cellules T avec une activité suppresseur. Après six jours de culture, les cellules de notre système peut être délimitée en cellules T naïves, les cellules T mémoires ou iTregs en fonction de leur expression relative de la CD25 et CD45RA. Comme les cellules T mémoires et naïves avoir des exigences différentes de polarisation signalés et plasticités 8, pré-tri de la population de cellules T initial en CD45RA + et CD45RO + sous-ensembles peuvent be utilisé pour examiner ces divergences. Conformément à d'autres, notre CD25 Salut CD45RA iTregs expriment des niveaux élevés de FoxP3 9, GITR et CTLA-4 11 et de faibles niveaux de CD127 12. À la suite FACS de chaque population, des cellules résultantes peut être utilisé dans un dosage suppresseur qui évalue la capacité par rapport à retarder la prolifération carboxyfluorescéine ester succinimidylique (CFSE)-marqué cellules T autologues.

Protocol

1. Isolement des cellules humaines mononucléaires du sang périphérique (CMSP) de couche leuco-plaquettaire Acquérir une unité de couche leuco-plaquettaire de l'hôpital ou à proximité emplacement en centre-sang. Notre centre de transfusion nous donne environ 40-60 ml de buffy coat unitaire obtenu à partir de donneurs de sang normaux. Verser le sang dans un autoclave 500 ml flacon en verre contenant du PBS stérile pour diluer couche leuco-plaquettaire. Le volume final de PBS manteau + bu…

Discussion

Alors que le transfert de Treg détient d'énormes promesses thérapeutiques dans la lutte contre le rejet de greffe auto-immunité et d'autres troubles immunitaires ou inflammatoires à médiation, les méthodes pour leur production efficace et un maintien stable n'ont pas encore été développé. Comme seulement 1-5% des cellules T humaines circulant sont Tregs, leur expansion contrôlée et la différenciation de surmonter ce manque comme un obstacle majeur de la mise en œuvre des Tregs dans la clinique…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

<p class="jove_content"> Les auteurs tiennent à remercier Jennifer Strange et Greg Bauman pour leur aide à l'analyse cytométrie en flux et tri. Ce travail a été soutenu par le NIH Grant Nombre 2P20 RR020171 de la NCRR et par l'Université de fonds de démarrage du Kentucky à la bande FM; GIE reconnaît le soutien de la bourse d'études supérieures présidentielle et le Mouvement des chances Kentucky.</p

Materials

Name of the reagent Company Catalogue Number Comments
Lymphoprep Axis-Shield 1114547 Keep at room temperature
Refrigerated Bench-Top Centrifuge Eppendorf 5810R  
Bright-Line Hemocytometer Hausser Scientific 3110  
EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19052  
EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19157  
EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19155  
The Big Easy EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18001 Silver
5 mL Round Bottom Polystyrene Tubes BD Falcon 352008  
15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes VWR 89004-368  
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tubes BD Falcon 352059  
50 mL Polypropylene Centrifuge Tubes VWR 89004-364  
Human anti-CD3 Antibody Bio X Cell BE0001-2 Clone: OKT3
24 Well Cell Polystyrene Culture Plate BD Falcon 353047  
96 Well Round Bottom Tissue Culture Plate Grenier Bio-One 650180  
RPMI 1640 with Glutamax-I and HEPES Buffer Gibco 72400  
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000  
β-Mercaptoethanol Sigma M7522  
Recombinant Human TGF-β1 eBioscience 14-8348-62  
Recombinant Human IL-2 eBioscience 14-8029-63  
Bovine Serum Albumin (BSA) MP Biomedicals Inc. 810531  
0.5 M EDTA Amresco E177  
Mouse Anti-Human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024 Clone: 4E3
Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 eBioscience 15-0458-42 Clone: HI100
Mouse Anti-Human CD127-APC Miltenyi Biotec 130-094-890 Clone: MB15-18C9
DNase II MP Biomedicals Inc. 190370  
MoFlo Flow Cytometer Beckman Coulter    
FlowJo Software Tree Star, Inc.    
Cell Quest Pro Software BD Biosciences    
Newborn Calf Serum Gibco 16010  
L-glutamine Gibco 25030  
AIM-V Gibco 0870112  
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Invitrogen C34554  
Treg Suppression Inspector Beads Miltenyi Biotec 130-092-909  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140  
40 μM Nylon Cell Strainer BD Falcon 352340  

References

  1. Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity. The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).
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Cite This Article
Ellis, G. I., Reneer, M. C., Vélez-Ortega, A. C., McCool, A., Martí, F. Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Naïve and Memory T Cells. J. Vis. Exp. (62), e3738, doi:10.3791/3738 (2012).

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