Summary

Genereren van Induced regulatoire T-cellen uit primaire menselijke naïef en geheugen T-cellen

Published: April 16, 2012
doi:

Summary

Wij beschrijven een werkwijze voor het regulerende, geheugen naïeve T-cellen van een menselijke bloed donoren. Gepolariseerde Tregs kan worden vergeleken met andere subgroepen in verschillende genetische en functionele toepassingen met genetische homogeniteit, zoals onderdrukking assay ook hier beschreven.

Abstract

De ontwikkeling en het onderhoud van immunosuppressieve CD4 + regulatoire T-cellen (Tregs) dragen bij tot de perifere tolerantie die nodig is om in de immunologische homeostase te blijven met de enorme hoeveelheid van het zelf en commensale antigenen in en op het menselijk lichaam. Verstoringen in de balans tussen Tregs en inflammatoire conventionele T-cellen kan leiden tot immunopathologie of kanker. Hoewel de therapeutische injectie van Tregs is aangetoond effectief te zijn in muismodellen van colitis 1, type I diabetes 2, reumatoïde artritis en graft versus host disease, 4 verschillende fundamentele verschillen in de mens versus de muis Treg biologie 5 is tot nu toe uitgesloten klinisch gebruik. Het gebrek aan voldoende, zuiverheid, stabiliteit en homing specificiteit van therapeutische Tregs noodzakelijk een dynamisch platform van de menselijke Treg ontwikkeling waarop de voorwaarden te optimaliseren voor hun ex vivo expansie 6.

Hier hebben we D Derenderen een methode voor de differentiatie van de geïnduceerde Tregs (iTregs) van een humaan perifeer bloed donor die kunnen worden onderverdeeld in vier stadia: isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen, magnetische selectie van CD4 + T-cellen, in vitro celkweek en fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) van T-cel subsets. Aangezien de Treg handtekening transcriptiefactor forkhead box P3 (Foxp3) is een activatie geïnduceerde transcriptiefactor bij mensen 7 en andere unieke marker is, een combinatoriële panel van markers worden gebruikt om T-cellen herkennen suppressor activiteit. Na zes dagen kweken kunnen cellen in het systeem wordt begrensd in naïve T-cellen, T-cellen of geheugen iTregs basis van hun relatieve expressie van CD25 en CD45RA. Als het geheugen en de naïeve T-cellen hebben verschillende gemeld polarisatie eisen en plasticities 8, voorsortering van de eerste T-cel populatie in CD45RA + en CD45RO + subsets kunnen be gebruikt om deze verschillen te onderzoeken. In overeenstemming met anderen, onze CD25 Hi CD45RA iTregs hebben hoge niveaus van Foxp3 9, GITR en CTLA-4 11 en lage niveaus van CD127 12. Na FACS van elke populatie kunnen resulterende cellen worden gebruikt in een suppressor assay de relatieve vermogen om proliferatie van carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) gelabelde autologe T cellen te vertragen evalueert.

Protocol

1. Isolatie van de humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) van Buffy Coat Verwerven van een eenheid van buffycoat uit het ziekenhuis of in de omgeving bloed locatie in het centrum. Ons bloed centrum voorziet ons van ongeveer 40-60 ml buffycoat per eenheid verkregen van normaal bloed donoren. Giet het bloed in een autoclaaf 500 ml glazen fles met steriel PBS tot buffycoat verdunnen. Het eindvolume van PBS + buffy coat moet 250 ml. Vul tien 50 ml conische buizen met elk 20 ml…

Discussion

Terwijl Treg overdracht bezit enorme therapeutische belofte bij de bestrijding van auto-immuniteit afstoting van het transplantaat en andere immuun-of inflammatoire-gemedieerde aandoeningen, methoden voor hun efficiënte generatie en stabiele onderhoud zijn nog niet ontwikkeld. Aangezien slechts 1-5% van de circulerende humane T-cellen zijn Tregs, hun gecontroleerde expansie en differentiatie lost dit gebrek als een belangrijke afschrikkende werking van de uitvoering van Tregs in de kliniek. Aan de andere kant, zoals we…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

<p class="jove_content"> De auteurs willen Jennifer Strange en Greg Bauman bedanken voor hun hulp bij flowcytometrie-analyse en sortering. Dit werk werd ondersteund door de NIH Grant Aantal 2P20 RR020171 van de NCRR en door de Universiteit van Kentucky het opstarten van fondsen om FM; GIE erkent de steun van de presidentiële Graduate Fellowship en de Kentucky Opportunity Fellowship.</p

Materials

Name of the reagent Company Catalogue Number Comments
Lymphoprep Axis-Shield 1114547 Keep at room temperature
Refrigerated Bench-Top Centrifuge Eppendorf 5810R  
Bright-Line Hemocytometer Hausser Scientific 3110  
EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19052  
EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19157  
EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19155  
The Big Easy EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18001 Silver
5 mL Round Bottom Polystyrene Tubes BD Falcon 352008  
15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes VWR 89004-368  
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tubes BD Falcon 352059  
50 mL Polypropylene Centrifuge Tubes VWR 89004-364  
Human anti-CD3 Antibody Bio X Cell BE0001-2 Clone: OKT3
24 Well Cell Polystyrene Culture Plate BD Falcon 353047  
96 Well Round Bottom Tissue Culture Plate Grenier Bio-One 650180  
RPMI 1640 with Glutamax-I and HEPES Buffer Gibco 72400  
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000  
β-Mercaptoethanol Sigma M7522  
Recombinant Human TGF-β1 eBioscience 14-8348-62  
Recombinant Human IL-2 eBioscience 14-8029-63  
Bovine Serum Albumin (BSA) MP Biomedicals Inc. 810531  
0.5 M EDTA Amresco E177  
Mouse Anti-Human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024 Clone: 4E3
Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 eBioscience 15-0458-42 Clone: HI100
Mouse Anti-Human CD127-APC Miltenyi Biotec 130-094-890 Clone: MB15-18C9
DNase II MP Biomedicals Inc. 190370  
MoFlo Flow Cytometer Beckman Coulter    
FlowJo Software Tree Star, Inc.    
Cell Quest Pro Software BD Biosciences    
Newborn Calf Serum Gibco 16010  
L-glutamine Gibco 25030  
AIM-V Gibco 0870112  
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Invitrogen C34554  
Treg Suppression Inspector Beads Miltenyi Biotec 130-092-909  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140  
40 μM Nylon Cell Strainer BD Falcon 352340  

References

  1. Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity. The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).
  2. Tarbell, K. V. Dendritic cell-expanded, islet-specific CD4+ CD25+ CD62L+ regulatory T cells restore normoglycemia in diabetic NOD mice. The Journal of Experimental Medicine. 204, 191-201 (2007).
  3. Morgan, M. E. Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells. Arthritis and Rheumatism. 52, 2212-2221 (2005).
  4. Taylor, P. A., Lees, C. J., Blazar, B. R. The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality. Blood. 99, 3493-3493 (2002).
  5. Ziegler, S. F. FOXP3: of mice and men. Annual Review of Immunology. 24, 209-226 (2006).
  6. Riley, J. L., June, C. H., Blazar, B. R. Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning. Immunity. 30, 656-6565 (2009).
  7. Morgan, M. E. Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+ T regulatory cells in humans. Human Immunology. 66, 13-20 (2005).
  8. Wang, J., Huizinga, T. W. J., Toew, R. E. M. De Novo Generation and Enhanced Suppression of Human CD4+CD25+ Regulatory T Cells by Retinoic Acid. Journal of Immunology. 183, 4119-4126 (2009).
  9. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science (New York, N.Y.). 299, 1057-1061 (2003).
  10. McHugh, R. S. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16, 311-323 (2002).
  11. Takahashi, T. Immunologic Self-Tolerance Maintained by Cd25+Cd4+Regulatory T Cells Constitutively Expressing Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen 4. The Journal of Experimental Medicine. 192, 303-310 (2000).
  12. Liu, W. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. The Journal of Experimental Medicine. 203, 1701-1711 (2006).
  13. Schraven, B., Kalinke, U. CD28 superagonists: what makes the difference in humans. Immunity. 28, 591-595 (2008).
  14. Reneer, M. C. Peripherally induced human Regulatory T cells uncouple Kv1.3 activation from TCR-associated signaling. European Journal of Immunology. , (2011).

Play Video

Cite This Article
Ellis, G. I., Reneer, M. C., Vélez-Ortega, A. C., McCool, A., Martí, F. Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Naïve and Memory T Cells. J. Vis. Exp. (62), e3738, doi:10.3791/3738 (2012).

View Video