Summary

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

Published: April 16, 2012
doi:

Summary

Wir beschreiben ein Verfahren zum Erzeugen regulatorische, Speicher und naive T-Zellen aus einem einzelnen menschlichen Blutspender. Polarisierten Tregs können dann auf andere Teilmengen in einer Vielzahl von genetischen und funktionelle Anwendungen mit genetische Homogenität, einschließlich einer Unterdrückung Assay auch hier detailliert verglichen werden.

Abstract

Die Entwicklung und Pflege von immunsuppressiven CD4 + regulatorischen T-Zellen (Tregs) Mitwirkung an der peripheren Toleranz notwendig, um in immunologischen Homöostase mit der großen Menge von sich selbst und kommensalen Antigene in und auf den menschlichen Körper verbleiben. Störungen in der Balance zwischen Treg und entzündlichen konventionellen T-Zellen können in Immunpathologie oder Krebs führen. Obwohl therapeutische Injektion von Tregs gezeigt wurde, dass sein in Mausmodellen der Colitis 1, Diabetes Typ I 2, rheumatoider Arthritis und graft versus host disease, 4 einige grundlegende Unterschiede in der menschlichen Biologie im Vergleich zu Maus Treg 5 wirksam ist bislang klinischen Einsatz ausgeschlossen. Das Fehlen einer ausreichenden Zahl, Reinheit, Stabilität und Spezifität der therapeutischen Homing Tregs erforderte eine dynamische Plattform des menschlichen Treg Entwicklung, auf denen Voraussetzungen für ihre ex vivo Expansion von 6 bis zu optimieren.

Hier we describe ein Verfahren zur Differenzierung von induzierten Tregs (iTregs) aus einem einzigen menschlichen peripheren Blut-Donor, bei dem in vier Stufen unterteilt werden: Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen, magnetische Selektion von CD4 + T-Zellen in vitro Zellkultur und Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) von T-Zell-Untergruppen. Da die Treg Unterschrift Transkriptionsfaktors forkhead box P3 (FOXP3) ist ein Aktivierungs-induzierten Transkriptionsfaktor beim Menschen 7 und keine andere einzigartige Marker vorhanden ist, eine kombinatorische Panel von Markern muss verwendet werden, um T-Zellen mit Suppressor-Aktivität zu identifizieren. Nach sechs Tagen in Kultur, kann Zellen in unserem System in naive T-Zellen, Gedächtnis-T-Zellen oder iTregs ihrer relativen Expression von CD25 und CD45RA Basis abgegrenzt werden. Als Erinnerung und naiven T-Zellen unterschiedlicher Polarisation berichtet Anforderungen und Plastizitäten 8 haben, Vorsortierung des ursprünglichen T-Zell-Population in CD45RA + und CD45RO + Teilmengen können be verwendet, um diese Unstimmigkeiten zu prüfen. In Übereinstimmung mit anderen, unsere CD25 Hallo CD45RA iTregs Express ein hohes Maß an FoxP3 9, GITR und CTLA-4-11 und geringe Mengen an CD127 12. Nach FACS jeder Population, kann resultierenden Zellen in einer Suppressor-Assay, der die relativen Fähigkeit, die Proliferation von Carboxyfluorescein-succinimidylester (CFSE)-markierten autologen T-Zellen verzögert bewertet werden.

Protocol

1. Isolierung von humanen peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) aus Buffy-Coat- Erwerben Sie eine Einheit der Buffy-Coat aus dem Krankenhaus oder in der Nähe Blut im Stadtzentrum. Unser Blut Zentrum bietet uns etwa 40-60 ml Buffy-Coat pro Einheit von normalen Blutspendern gewonnen. Gießen Sie das Blut in einer autoklavierten 500 ml Glasflasche mit sterilem PBS zu verdünnen Buffy-Coat. Das Endvolumen des PBS + Leukozytenmanschette sollte 250 ml sein. Füllen Sie zehn 50 ml konische R?…

Discussion

Während Treg Transfer birgt ein enormes therapeutisches Versprechen im Kampf gegen Autoimmunität Transplantatabstoßung und anderen Immunerkrankungen oder entzündlichen vermittelten Erkrankungen, Methoden für ihre effiziente Erzeugung und Aufrechterhaltung stabiler sind noch nicht entwickelt worden. Da nur 1-5% der zirkulierenden humanen T-Zellen Tregs sind, überwindet ihre kontrollierte Expansion und Differenzierung dieser Mangel als eine große Abschreckung der Umsetzung der Tregs in die Klinik. Auf der anderen S…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

<p class="jove_content"> Die Autoren möchten sich Jennifer Strange und Greg Bauman für ihre Hilfe bei Durchflusszytometrie-Analyse und-sortierung zu danken. Diese Arbeit wurde von den NIH Grant Number 2P20 RR020171 aus dem NCRR und von der University of Kentucky Startup-Fonds FM unterstützt; GIE erkennt die Unterstützung des Präsidiums und der Graduate Fellowship Kentucky Chance Fellowship.</p

Materials

Name of the reagent Company Catalogue Number Comments
Lymphoprep Axis-Shield 1114547 Keep at room temperature
Refrigerated Bench-Top Centrifuge Eppendorf 5810R  
Bright-Line Hemocytometer Hausser Scientific 3110  
EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19052  
EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19157  
EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19155  
The Big Easy EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18001 Silver
5 mL Round Bottom Polystyrene Tubes BD Falcon 352008  
15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes VWR 89004-368  
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tubes BD Falcon 352059  
50 mL Polypropylene Centrifuge Tubes VWR 89004-364  
Human anti-CD3 Antibody Bio X Cell BE0001-2 Clone: OKT3
24 Well Cell Polystyrene Culture Plate BD Falcon 353047  
96 Well Round Bottom Tissue Culture Plate Grenier Bio-One 650180  
RPMI 1640 with Glutamax-I and HEPES Buffer Gibco 72400  
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000  
β-Mercaptoethanol Sigma M7522  
Recombinant Human TGF-β1 eBioscience 14-8348-62  
Recombinant Human IL-2 eBioscience 14-8029-63  
Bovine Serum Albumin (BSA) MP Biomedicals Inc. 810531  
0.5 M EDTA Amresco E177  
Mouse Anti-Human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024 Clone: 4E3
Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 eBioscience 15-0458-42 Clone: HI100
Mouse Anti-Human CD127-APC Miltenyi Biotec 130-094-890 Clone: MB15-18C9
DNase II MP Biomedicals Inc. 190370  
MoFlo Flow Cytometer Beckman Coulter    
FlowJo Software Tree Star, Inc.    
Cell Quest Pro Software BD Biosciences    
Newborn Calf Serum Gibco 16010  
L-glutamine Gibco 25030  
AIM-V Gibco 0870112  
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Invitrogen C34554  
Treg Suppression Inspector Beads Miltenyi Biotec 130-092-909  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140  
40 μM Nylon Cell Strainer BD Falcon 352340  

References

  1. Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity. The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).
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Cite This Article
Ellis, G. I., Reneer, M. C., Vélez-Ortega, A. C., McCool, A., Martí, F. Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Naïve and Memory T Cells. J. Vis. Exp. (62), e3738, doi:10.3791/3738 (2012).

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