Summary

Geração de Células T reguladoras induzidas a partir de células T humanas primárias Naïve e Memória

Published: April 16, 2012
doi:

Summary

Nós descrevemos um método para a geração de células T de memória, regulamentar e ingénuos a partir de um único dador de sangue humano. Tregs polarizada pode ser então comparada com outros subconjuntos de uma variedade de aplicações genéticas e funcionais com homogeneidade genética, incluindo um ensaio de supressão também detalhados aqui.

Abstract

O desenvolvimento e manutenção das células T CD4 + de imunossupressores células T reguladoras (Tregs) contribuem para a tolerância periférica necessária para permanecer na homeostase imunológica com a grande quantidade de antigénios próprios e comensais e no corpo humano. Perturbações no equilíbrio entre Tregs e inflamatórias células T convencionais podem resultar em imunopatologia ou cancro. Embora a injecção terapêutica de Tregs foi mostrado para ser eficaz em modelos murinos de colite 1, diabetes tipo I 2, artrite reumatóide e doença do enxerto versus hospedeiro, 4 várias diferenças fundamentais em humanos versus rato Treg biologia 5 tem, até agora impedida a utilização clínica. A falta de um número suficiente, pureza, estabilidade e especificidade de homing terapêutico Tregs exigiu uma plataforma dinâmica do desenvolvimento Treg humana em que para optimizar as condições para a sua expansão ex vivo 6.

Aqui nós Dcircunscrever um método para a diferenciação de induzida Tregs (iTregs) a partir de um único dador de sangue periférico humano, que pode ser dividido em quatro etapas: isolamento de células mononucleares do sangue periférico, a selecção magnética de células T CD4 +, em cultura celular in vitro e fluorescência activado separação de células (FACS) de subconjuntos de células T. Uma vez que o factor de transcrição Treg assinatura P3 caixa forkhead (FoxP3) é um factor de transcrição induzida por activação em seres humanos 7 e sem outros marcadores únicos existe, um painel de combinatória de marcadores, deve ser utilizado para identificar as células T com actividade supressora. Depois de seis dias em cultura, as células no nosso sistema pode ser demarcada em naive células T, células T de memória ou iTregs com base na sua expressão relativa de CD25 e CD45RA. Como as células T de memória e naïve têm diferentes requisitos de polarização relatados e plasticidades 8, pré-triagem da população inicial de células T em CD45RA + e CD45RO + subconjuntos pode be usado para examinar essas discrepâncias. Consistente com os outros, nossa CD25 Hi CD45RA níveis elevados de iTregs expressas FoxP3 9, GITR e CTLA-4 11 e baixos níveis de CD127 12. Na sequência de FACS de cada população, as células resultantes podem ser utilizados num ensaio de supressor que avalia a capacidade relativa para retardar a proliferação de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE)-rotulado células T autólogas.

Protocol

1. Isolamento de Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de Buffy Coat Adquirir uma unidade de revestimento buffy do hospital ou centro de localização nas proximidades de sangue. Nosso centro de sangue nos fornece cerca de 40-60 mL de buffy coat por unidade obtido a partir de doadores de sangue normais. Derrame sangue em uma garrafa de vidro esterilizada contendo 500 mL PBS estéril para diluir buffy coat. O volume final de PBS + buffy coat deve ser de 250 mL. Encha dez 50 m…

Discussion

Enquanto a transferência Treg promissora terapêutico no combate enorme rejeição do enxerto autoimunidade e outras desordens imunitárias ou inflamatórias mediadas, métodos para a sua geração eficiente e manutenção estável ainda não tenham sido desenvolvidos. Como apenas 1-5% de circulação de células T humanas são Tregs, a sua expansão controlada e diferenciação supera esta escassez como um impedimento principal da aplicação de Tregs na clínica. Por outro lado, como aprendemos com o julgamento TGN14…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

<p class="jove_content"> Os autores gostariam de agradecer a Jennifer Strange e Greg Bauman para a sua assistência com a análise de Citometria de Fluxo e classificação. Este trabalho foi financiado pelo NIH Grant Número 2P20 RR020171 do NCRR e pela Universidade de Kentucky fundos de inicialização para FM; GIE agradece o apoio da Sociedade de Pós-Graduação Presidencial e da Irmandade Opportunity Kentucky.</p

Materials

Name of the reagent Company Catalogue Number Comments
Lymphoprep Axis-Shield 1114547 Keep at room temperature
Refrigerated Bench-Top Centrifuge Eppendorf 5810R  
Bright-Line Hemocytometer Hausser Scientific 3110  
EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19052  
EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19157  
EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19155  
The Big Easy EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18001 Silver
5 mL Round Bottom Polystyrene Tubes BD Falcon 352008  
15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes VWR 89004-368  
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tubes BD Falcon 352059  
50 mL Polypropylene Centrifuge Tubes VWR 89004-364  
Human anti-CD3 Antibody Bio X Cell BE0001-2 Clone: OKT3
24 Well Cell Polystyrene Culture Plate BD Falcon 353047  
96 Well Round Bottom Tissue Culture Plate Grenier Bio-One 650180  
RPMI 1640 with Glutamax-I and HEPES Buffer Gibco 72400  
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000  
β-Mercaptoethanol Sigma M7522  
Recombinant Human TGF-β1 eBioscience 14-8348-62  
Recombinant Human IL-2 eBioscience 14-8029-63  
Bovine Serum Albumin (BSA) MP Biomedicals Inc. 810531  
0.5 M EDTA Amresco E177  
Mouse Anti-Human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024 Clone: 4E3
Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 eBioscience 15-0458-42 Clone: HI100
Mouse Anti-Human CD127-APC Miltenyi Biotec 130-094-890 Clone: MB15-18C9
DNase II MP Biomedicals Inc. 190370  
MoFlo Flow Cytometer Beckman Coulter    
FlowJo Software Tree Star, Inc.    
Cell Quest Pro Software BD Biosciences    
Newborn Calf Serum Gibco 16010  
L-glutamine Gibco 25030  
AIM-V Gibco 0870112  
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Invitrogen C34554  
Treg Suppression Inspector Beads Miltenyi Biotec 130-092-909  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140  
40 μM Nylon Cell Strainer BD Falcon 352340  

References

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Cite This Article
Ellis, G. I., Reneer, M. C., Vélez-Ortega, A. C., McCool, A., Martí, F. Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Naïve and Memory T Cells. J. Vis. Exp. (62), e3738, doi:10.3791/3738 (2012).

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