Summary

La cuantificación de la colonización por hongos, esporogenesis y producción de micotoxinas mediante bioensayos del núcleo

Published: April 23, 2012
doi:

Summary

La devastación de los cultivos de cereales de semillas por los hongos que infectan ha llevado a los numerosos esfuerzos de investigación para comprender mejor las interacciones planta-patógeno. Para estudiar las interacciones entre las semillas de hongos en un entorno de laboratorio, hemos desarrollado un método robusto para la cuantificación de reproducción de los hongos, la biomasa y la contaminación por micotoxinas mediante bioensayos del kernel.

Abstract

La descomposición de granos por semilla-hongos que infectan plantea uno de los mayores desafíos económicos a la producción de cereales en todo el mundo, por no hablar de los riesgos graves para la salud humana y animal. Entre la producción de cereales, el maíz es sin duda el cultivo más afectado, debido a patógenos inducida por pérdidas en la integridad del grano y la contaminación de las semillas de micotoxinas. Los dos micotoxinas más comunes y problemáticas de los productores de maíz y de alimentos y procesadores de alimentos son las aflatoxinas y las fumonisinas, producida por Aspergillus flavus y Fusarium verticillioides, respectivamente.

Recientes estudios moleculares de las interacciones planta-patógeno han demostrado promesa en la comprensión de los mecanismos específicos asociados con la respuesta de las plantas a la infección por hongos y la contaminación por micotoxinas 1,2,3,4,5,6. Debido a que muchos laboratorios están utilizando ensayos del núcleo para estudiar patógenos de plantas interacciones, existe una necesidad de un método normalizado para la cuantificación de diferentes parámetros biológicos, asíresultados de distintos laboratorios se puede interrogar a interpretar. Para un método eficaz y reproducible para el análisis cuantitativo de las semillas, se han desarrollado ensayos de laboratorio en el núcleo y los métodos siguientes para cuantificar el crecimiento de hongos, la biomasa y la contaminación por micotoxinas. Cuatro esterilizados granos de maíz se inoculan en viales de vidrio con una suspensión fúngica (10 6) y se incubaron durante un período predeterminado. Viales de muestras se seleccionan entonces para la enumeración de los conidios por análisis de biomasa hemocitómetro, ergosterol basada por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), la cuantificación de aflatoxinas utilizando un método AflaTest fluorómetro, y cuantificación fumonisina por HPLC.

Protocol

1. Bioensayo grano de maíz Dos semanas antes, la cultura de los hongos patógenos en Agar Papa Dextrosa (PDA) a 28 ° C. Seleccione granos con un tamaño y forma similar, preferentemente plana por lo que estaba a nivel con la parte inferior de los viales de bioensayo, y el lugar en 50 ml tubos Falcon. Granos seleccionados deben haber sido producidos simultáneamente en un mismo entorno para asegurarse de edad de la semilla o composición similar metabolito. Surface esterilizar núcleos ag…

Discussion

<p class="jove_content"> Los métodos descritos aquí se ha probado extensamente y ha demostrado ser robusta en la generación de resultados cuantificables para la colonización por hongos, esporogenesis, y la producción de micotoxinas. Por otra parte, estos métodos deben ser aplicables a las semillas de otras especies de plantas que son susceptibles a la contaminación con hongos micotoxigénicos (por ejemplo, los cacahuetes, trigo, algodón, pistachos, etc.) Para competentes los análisis de interacción planta-patógeno, es imperativo q…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría dar las gracias a Brandon Hassett y Carlos Ortiz por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la NSF subvenciones IOB-0544428, el IOS-0951272, 0925561 y IOS-con el Dr. Michael Kolomiets, y por el Instituto Nacional del USDA de Alimentos y Agricultura (NIFA), Mejoramiento Vegetal y AFRI Educación Grant # 2010-85117 -20539 a los Dres. Seth Murray, Isakeit Thomas y Michael Kolomiets.

Materials

Name of the reagent Company Catalog #
Potato Dextrose Agar Fisher Scientifc S71659A
Tween-20 Fisher Scientifc BP337-100
Plastic incubation container Sterilite 1713LAB06
Blender Vicam 20200
24 cm Fluted Filter Papers Vicam 31240
1.5 μm glass microfibre Vicam 31955
Afla Test column Vicam G1024
Afrla Test Developer Vicam 32010
Methanol Vicam 35016
Acetonitrile Fisher Scientifc AC14952-0025
Ethanol Fisher Scientifc AC39769-0025
C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) Fisher Scientifc 60108-304
O-phthalaldehyde (OPA) Sigma Chemical Co 79760-5g
Boric acid Fisher Scientifc BP168-500
Sodium borate Fisher Scientifc RDCS0330500
Mercaptoethanol Fisher Scientifc 45-000-231
Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) Shimadzu Scientific Instruments, Inc. LC-20AT
Zorbax ODS column (4.6x150mm) Agilent Technologies 443905-902
Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector Shimadzu Scientific Instruments, Inc. RF-10AXL
Sodium phosphate Fisher Scientifc AC38987-0010
FB1 standards Sigma Chemical Co. F1147-1mg
Chloroform VWR MK444410
13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) Pall Life Science 4426
Ergosterol Sigma-Aldrich 45480-50G-F
Scintillation vials VWR 66021-602
Sodium Chloride Vicam G1124

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Cite This Article
Christensen, S., Borrego, E., Shim, W., Isakeit, T., Kolomiets, M. Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays. J. Vis. Exp. (62), e3727, doi:10.3791/3727 (2012).

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