Summary

Die Quantifizierung der Pilzbesiedlung, Sporogenese und Produktion von Mykotoxinen Kernel-Bioassays

Published: April 23, 2012
doi:

Summary

Die Verwüstung von Getreide durch Samen-Pilzresistenz hat zahlreiche Forschungsarbeiten zum besseren Verständnis Pflanze-Pathogen-Interaktionen dazu aufgefordert werden. Um Saatgut-Pilz-Interaktionen in einem Labor untersuchen, entwickelten wir eine robuste Methode zur Quantifizierung von Pilz-Reproduktion, Biomasse und Mykotoxinkontamination mit Kernel Bioassays.

Abstract

Die Verrottung der Körner durch Samen-Pilzresistenz stellt eine der größten wirtschaftlichen Herausforderungen zu Getreideproduktion weltweit, nicht zu ernsthaften Gefahren für die menschliche und tierische Gesundheit zu erwähnen. Unter Getreideproduktion ist Mais wohl die betroffenen Kultur, durch Pathogen-induzierte Verluste in Korn Integrität und Mykotoxin-Verunreinigung von Saatgut. Die beiden am weitesten verbreiteten und problematisch für Mykotoxine Maiserzeuger und Lebens-und Futtermittel-Prozessoren sind Aflatoxin und Fumonisin, durch Aspergillus flavus und Fusarium verticillioides produziert bzw..

Neuere Untersuchungen in der molekularen Pflanze-Pathogen-Interaktionen haben Versprechen für das Verständnis spezifischer Mechanismen mit pflanzlichen Reaktionen auf Pilzinfektion und Mykotoxinkontamination 1,2,3,4,5,6 verbunden demonstriert. Da viele Labs verwenden Kernel-Assays, um Pflanzen-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen, besteht ein Bedarf für ein standardisiertes Verfahren zur Quantifizierung von unterschiedlichen biologischen Parameter, soErgebnisse aus verschiedenen Laboratorien können Cross-interpretiert werden. Für eine robuste und reproduzierbare Mittel für quantitative Analysen auf Saatgut, haben wir im Labor Kernel-Assays und anschließender Methoden entwickelt, um das Pilzwachstum, Biomasse und Mykotoxinkontamination quantifizieren. Vier sterilisiert Maiskörner in Glasfläschchen mit einer Pilz-Suspension (10 6) beimpft und für einen vorbestimmten Zeitraum. Probenfläschchen werden dann für die Zählung von Conidien mit einem Hämocytometer, Ergosterin-Biomasse Analyse ausgewählt durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC), Aflatoxin Quantifizierung mit Hilfe eines AflaTest Fluorometer Verfahren und Fumonisin Quantifizierung durch HPLC.

Protocol

1. Maiskorn Bioassay Zwei Wochen vor, die Kultur pilzliche Erreger auf Kartoffeldextroseagar (PDA) bei 28 ° C Wählen Kerne mit ähnlicher Größe und Form, vorzugsweise abgeflacht, so dass sie auf Höhe der Unterkante der Bioassay Fläschchen, und in 50 ml Falcon-Röhrchen zu legen. Kernel ausgewählt werden, müssen produziert worden sind gleichzeitig in derselben Umgebung, um ähnliche Samen Alters-und Metabolit-Zusammensetzung zu gewährleisten. Oberfläche sterilisiert Kernel, die vo…

Discussion

<p class="jove_content"> Die hier beschriebenen Methoden wurden ausgiebig getestet und bewiesen, dass bei der Erzeugung von quantifizierbare Ergebnisse für Pilzbesiedlung, Sporogenese und Produktion von Mykotoxinen robust. Darüber hinaus sollte diese Methoden für Samen von anderen Pflanzenarten, die anfällig für Verunreinigung mit mycotoxigenic Pilze (zB Erdnüsse, Weizen, Baumwolle, Pistazien, etc.). Für kompetente Pflanze-Pathogen-Interaktion analysiert, ist es unerlässlich, dass die Samen am Leben gehalten werden. Eine kleine Wunde…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten Brandon Hassett und Carlos Ortiz für ihre technische Unterstützung zu danken. Diese Arbeit wurde von der NSF Zuschüsse IOB-0544428, 0951272-IOS, IOS-0925561 und an Dr. Michael Kolomiets unterstützt und von der USDA National Institute of Food and Agriculture (NIFA), Afri Pflanzenzüchtung und Bildung Grant # 2010-85117 -20539 bis Drs. Seth Murray, Thomas Isakeit, und Michael Kolomiets.

Materials

Name of the reagent Company Catalog #
Potato Dextrose Agar Fisher Scientifc S71659A
Tween-20 Fisher Scientifc BP337-100
Plastic incubation container Sterilite 1713LAB06
Blender Vicam 20200
24 cm Fluted Filter Papers Vicam 31240
1.5 μm glass microfibre Vicam 31955
Afla Test column Vicam G1024
Afrla Test Developer Vicam 32010
Methanol Vicam 35016
Acetonitrile Fisher Scientifc AC14952-0025
Ethanol Fisher Scientifc AC39769-0025
C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) Fisher Scientifc 60108-304
O-phthalaldehyde (OPA) Sigma Chemical Co 79760-5g
Boric acid Fisher Scientifc BP168-500
Sodium borate Fisher Scientifc RDCS0330500
Mercaptoethanol Fisher Scientifc 45-000-231
Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) Shimadzu Scientific Instruments, Inc. LC-20AT
Zorbax ODS column (4.6x150mm) Agilent Technologies 443905-902
Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector Shimadzu Scientific Instruments, Inc. RF-10AXL
Sodium phosphate Fisher Scientifc AC38987-0010
FB1 standards Sigma Chemical Co. F1147-1mg
Chloroform VWR MK444410
13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) Pall Life Science 4426
Ergosterol Sigma-Aldrich 45480-50G-F
Scintillation vials VWR 66021-602
Sodium Chloride Vicam G1124

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Cite This Article
Christensen, S., Borrego, E., Shim, W., Isakeit, T., Kolomiets, M. Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays. J. Vis. Exp. (62), e3727, doi:10.3791/3727 (2012).

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