Summary

Quantification de la colonisation fongique, sporogénèse, et la production de mycotoxines utilisant Bioassays noyau

Published: April 23, 2012
doi:

Summary

La dévastation des cultures céréalières par moisissures infectant les semences a incité de nombreux efforts de recherche afin de mieux comprendre les interactions plante-pathogène. Pour étudier les semences fongiques interactions dans un environnement de laboratoire, nous avons développé une méthode robuste pour la quantification de la reproduction des champignons, la biomasse et contamination par les mycotoxines en utilisant des essais biologiques du noyau.

Abstract

Le pourrissement des grains par moisissures infectant les semences constitue l'un des plus grands défis économiques dans le monde entier à la production de céréales, sans parler des risques graves pour la santé humaine et animale. Parmi la production céréalière, le maïs est sans doute la culture la plus touchée, en raison de pertes dues à des agents pathogènes dans l'intégrité du grain et de la contamination des semences par les mycotoxines. Les deux mycotoxines les plus répandues et problématiques pour les producteurs de maïs et de la nourriture et les transformateurs d'alimentation sont les aflatoxines et les fumonisines, produite par Aspergillus flavus et Fusarium verticillioides, respectivement.

Des études récentes dans moléculaires des interactions plante-pathogène ont montré prometteur dans la compréhension des mécanismes spécifiques associés à des réponses de plantes à l'infection fongique et 1,2,3,4,5,6 contamination par les mycotoxines. Parce que de nombreux laboratoires sont en utilisant des tests du noyau pour étudier les interactions plante-pathogène, il existe un besoin pour une méthode normalisée pour quantifier différents paramètres biologiques, de sorterésultats des différents laboratoires peuvent être contre-interprété. Pour un moyen fiable et reproductible pour des analyses quantitatives sur les semences, nous avons développé des essais du noyau en laboratoire et des méthodes suivantes pour quantifier la croissance fongique, la biomasse, et la contamination par les mycotoxines. Quatre grains de maïs stérilisés sont inoculés dans des flacons en verre avec une suspension fongique (10 6) et incubé pendant une période prédéterminée. Flacons à échantillon sont ensuite sélectionnés pour le dénombrement des conidies par l'analyse de la biomasse hémocytomètre, basée sur l'ergostérol par chromatographie liquide haute performance (HPLC), la quantification aflatoxine en utilisant une méthode AflaTest fluorimètre, et la quantification des fumonisines par HPLC.

Protocol

1. Essais biologiques grain de maïs Deux semaines avant, la culture des champignons pathogènes sur Potato Dextrose Agar (PDA) à 28 ° C. Sélectionnez les noyaux avec la taille et de forme semblables, de préférence aplatie afin qu'ils jeter au niveau du fond des flacons de dosage biologique, et les placer dans des tubes de 50 ml de faucon. Noyaux sélectionnés doivent avoir été produites simultanément dans un même environnement pour assurer l'âge de semences ou de composition anal…

Discussion

<p class="jove_content"> Les méthodes décrites ici ont été largement testées et éprouvées pour être robuste dans la génération des résultats quantifiables pour la colonisation fongique, sporogénèse, et la production de mycotoxines. En outre, ces méthodes devraient être applicables aux semences des espèces végétales autres qui sont sensibles à la contamination par des champignons (par exemple les arachides mycotoxigéniques, blé, coton, pistaches, etc.) Pour compétentes analyses d'interaction plante-pathogène, il est…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Brandon Hassett et Carlos Ortiz pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par la NSF subventions IOB-0544428, 0951272-IOS, IOS et-0925561 au Dr Michael Kolomiets, et par l'Institut national de l'USDA pour l'alimentation et l'agriculture (NIFA), l'amélioration des plantes et de l'éducation AFRI Grant # 2010-85117 -20539 à MM. Seth Murray, Thomas Isakeit, et Kolomiets Michael.

Materials

Name of the reagent Company Catalog #
Potato Dextrose Agar Fisher Scientifc S71659A
Tween-20 Fisher Scientifc BP337-100
Plastic incubation container Sterilite 1713LAB06
Blender Vicam 20200
24 cm Fluted Filter Papers Vicam 31240
1.5 μm glass microfibre Vicam 31955
Afla Test column Vicam G1024
Afrla Test Developer Vicam 32010
Methanol Vicam 35016
Acetonitrile Fisher Scientifc AC14952-0025
Ethanol Fisher Scientifc AC39769-0025
C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) Fisher Scientifc 60108-304
O-phthalaldehyde (OPA) Sigma Chemical Co 79760-5g
Boric acid Fisher Scientifc BP168-500
Sodium borate Fisher Scientifc RDCS0330500
Mercaptoethanol Fisher Scientifc 45-000-231
Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) Shimadzu Scientific Instruments, Inc. LC-20AT
Zorbax ODS column (4.6x150mm) Agilent Technologies 443905-902
Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector Shimadzu Scientific Instruments, Inc. RF-10AXL
Sodium phosphate Fisher Scientifc AC38987-0010
FB1 standards Sigma Chemical Co. F1147-1mg
Chloroform VWR MK444410
13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) Pall Life Science 4426
Ergosterol Sigma-Aldrich 45480-50G-F
Scintillation vials VWR 66021-602
Sodium Chloride Vicam G1124

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Christensen, S., Borrego, E., Shim, W., Isakeit, T., Kolomiets, M. Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays. J. Vis. Exp. (62), e3727, doi:10.3791/3727 (2012).

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